雪冰

叶贤林  深圳市血液中心输血相关传染病的预防和控制已成为全球关注的焦点问题，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性已大大降低，但由于病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染等因素，使得临床输血安全依然存在一定风险。核酸扩增技术（NAT）可直接检测病毒特有的核苷酸系列，该技术可将单一的病毒分子的DNA或RNA扩增十几亿倍以上，能够阻断可能逃过现行检测已被感染的血液，可将窗口期缩短到几天。从而有效预防输血传播疾病。NAT技术目前常用有PCR，TMA，NASBA，LCR，bDNA等，而常用于血液检测的主要有PCR和TMA。这两种技术检测限和特异性均相近。由于单个样本检测存在费用高和技术限制的问题，国际通用办法是实施混合血浆筛查，有反应性汇集池再单个检测，可以大大降低检测成本，且实验灵敏度满足目前的要求，已在国外广泛应用于血液常规筛查。
NAT技术在血液乙肝筛查中的必要性
自1971年开始，HBsAg作为常规筛查项目引入到血液筛查中，使得输血后感染乙肝的发生率大大降低，目前酶联免疫检测（ELISA）技术已经广泛应用于血液筛查，检测HBsAg的灵敏度已由最初30~50 ng/mL到现在的0.5~1.0 ng/mL，有的试剂甚至达到0.1 ng/mL以下，但每年仍有少量新发输血后肝炎病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1/6.3万，这些危险主要来自HBV“窗口期”、病毒变异、低病毒载量感染等。ELISA法筛查并不能根本排除病毒存在的危险，由于HBV感染后病毒颗粒先于HBsAg释放到血液中，在长达50多天的“窗口期”里，感染者HBsAg检测阴性，但其血液却具传染性，而使用NAT技术能提前20天筛查出HBsAg阴性、HBV DNA阳性献血者，因此，ELISA法的“窗口期”漏检是目前影响血液安全性进一步提高的瓶颈，对于献血者HBV的筛查，单纯的血清学检测并不能有效地保障血液安全。
血清学检测HBsAg阴性不能排除HBV感染已经成为共识，1978年Hoofnagle等首次报告抗-HBc阳性、HBsAg阴性的供血者可导致受血者HBV感染以后，大量文献报道证明了这种现象确实存在，引起输血传播HBV的主要是HBsAg阴性、HBV DNA阳性的献血者，有研究报告在HBV暴露率高达70%~90%的地区，献血者中有7%~19%为HBsAg阴性HBV 感染者，而在HBV暴露率低的地区，献血者中仅0%~9%为HBsAg阴性HBV感染者。HBsAg阴性HBV感染者的血清病毒一般保持低水平复制，抗原表达量低，HBV DNA通常＜104 IU/mL，目前所用ELISA试剂灵敏度难以检出。有研究证明HBsAg阴性而HBV DNA阳性血18%可导致输血后乙肝感染，而已有报道从隐匿性HBV感染者克隆出来的1个到10个病毒颗粒接种到猩猩身上可复制出典型HBV感染的临床表现，因此尽快推行血液核酸筛查是避免输血后HBV感染的有效措施。
NAT技术从理论上并不能完全消除HBV“窗口期”，但可以使输血传播HBV的危险性降到最低。研究表明在HBV高流行地区，即使采用50人份混样进行HBV DNA检测，与现有的灵敏度较高的ELISA检测及化学发光法相比，对“窗口期”样品仍有较高的检出率，即使目前改进的微粒子化学发光法（Microparticle Chemiluminescent）灵敏度高达0.005 ng/mL也只能检测出几百以上的病毒颗粒，因此在血液HBV常规筛查中引入NAT技术，对进一步降低HBV经输血传播的风险有显著意义。
国外NAT技术应用的现状
血液HBV筛查策略的选择取决于该地区HBV的流行率，传统的血清学检测主要包括两种模式，在流行率较低的地区如欧洲、美国（<3%）规定对献血者进行HBsAg和抗-HBc两项筛查，而流行率高的地区比如中国、新加坡、台湾地区，由于献血人群中HBcAb阳性率较高，对血液HBV筛查只检测HBsAg和ALT两项，在过去35年里HBV血清学检测确实使输血传播HBV的危险性大大降低，然而ELISA并不能根本排除病毒存在的危险，研究表明HBsAg阴性、抗-HBc阳性的健康人群中有10%HBV DNA阳性，抗-HBs和抗-HBc阳性的健康人群中有5%~15%HBV DNA阳性，尽管血清中病毒载量较低。因此对献血者HBV筛查迫切需要一种更为有效的方法，比如将可直接检测病毒核酸的NAT技术引入到血液常规筛查中。目前许多发达国家已将NAT技术引入到血液HCV/HIV RNA常规筛查项目中，考虑到成本原因，多采用混样检测，效果非常明显,如法国2001年NAT的使用使HCV、HIV的危险度分别由原来的1/86万、1/137万下降到1/830万、1/270万；美国NAT的使用使HCV、HIV分别由299/10万、9.7/10万下降到1/193.5万、1/213.5万。爱尔兰自1999年、2002年分别开始对HCV、HIV进行NAT检测，目前正在考虑对HBV进行单人份NAT检测，尽管2002年后在血液筛查中增加了抗-HBc检测，HBV的危险度已降至1/20万。在血液HBV常规筛查中增加NAT检测，许多国家也正处于探讨阶段，主要基于三个方面的考虑：①该地区的HBV流行率；②目前所用的ELISA筛查和NAT筛查效果相比较；③NAT筛查应该采用混样方式还是单人份检测，混样的标本量如何决定。目前开展血液HBV DNA常规筛查的主要有德国和日本，德国采用的是96人份混样检测，日本一开始采用500人份混合检测方案，三个月后改为50人份，目前采用20人份，两国多年来筛查HBV阳性率分别是1/462415和1/53976。新加坡和我国香港地区也在近期开展了HBV NAT常规检测。HBV流行率不同，采用的汇集检测方案不同，HBV DNA检出率亦不同。即使在低流行率国家，采用单份检测HBV DNA，检出率也有0.02%（新西兰）及0.038%（美国），而中流行率国家可达0.05%（印度），而高流行率国家高达0.14%（泰国）、0.5%（加纳）和0.54%（印尼）。
NAT技术在我国的应用情况
我国是乙型肝炎的高度流行区，最近的调查数据显示，人群（大于3岁）中HBsAg携带率为9.09%，HBV流行率高达60%以上，在这种乙肝高流行区人群中征集健康安全的医疗用血是相当困难的，目前我国血站的血液筛查都是使用ELISA方法，而我国的抗-HBc阳性率高达60%，因此对献血者的筛查主要检测HBsAg和ALT两项，由于该方法检测HBsAg ELISA国产试剂的灵敏度较底（灵敏度为0.5~1.0 ng/mL）及病毒“窗口期”、病毒变异等原因，使得血液筛查存在一定程度的漏检，给临床用血安全带来极大的威胁。目前国内已有一些血站尝试将NAT技术应用到血液HBV常规筛查中，深圳血液中心采用24人份混合方案进行HBV DNA检测，结果HBsAg阴性HBV DNA阳性率分别为为0.049%；宝安血站采用20人份混合检测，HBV DNA检出率为0.4%；安徽医科大学附属医院采用5人份混合检测，HBV DNA检出率为1.28%；青岛血站采用单人份检测，结果检出HBsAg阴性HBV DNA阳性标本6/300，阳性率为2%，浙江人民医院利用单人份检测对血库血液检测，HBV DNA阳性率为2.71%，大大高于国外献血者的检出率。
目前国内开展血液HBV DNA检测的血站多采用进口NAT试剂，国产NAT试剂亦在推广应用中。国产NAT试剂主要是因为试剂的灵敏度和特异性相对较低，虽然国内许多生物技术公司已经开发出成熟的NAT检测试剂，但这些目前较适用于临床诊断，而血液筛查和临床诊断是两个不同的领域，血液筛查对试剂的要求要比临床诊断高很多（例如对内标和灵敏度的要求相应非常高）。国际上迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛查的NAT试剂仅两种，即Roche PCR HBV/HCV/HIV检测体系及Chiron TMA技术，FDA评判NAT试剂能否用于血液筛查的标准之一是必须对50 cp/mL的HBV检出率>95%且特异性99%以上，国产试剂尚需不断改进以满足这一要求。
NAT检测需要注意的问题
NAT检测血液HBV DNA，效率很高，但作为常规筛查的方法，存在成本、试剂的可靠性及实验系统的质控等问题。
1. 灵敏度  除了对试剂本身的灵敏度有所要求外，汇集池大小也要满足灵敏度要求，混样标本数太多会使灵敏度降低，造成低滴度献血者漏检。研究表明目前所用的ELISA法检测，HBV“窗口期”大约51~59天，而采用16~24人份混样NAT检测，“窗口期”将缩短至40~50天，采用单人份检测，“窗口期”将缩短至15~34天。考虑到成本原因，目前国外采用的核酸筛查多为混样方式，而混样的多少不仅要满足试剂灵敏度的要求，还要考虑本地区的HBV流行率，流行率高的地区应尽可能的采用少混合数（<8人份）大混合量（单样本大于100微升）检测，甚至单份检测，以提高检测效率。
2. 特异性  血液筛查对试剂的特异性要求较高，尽管目前应用于临床诊断的有些国产NAT试剂特异性已很高，但考虑到血液筛查样本量大，易因样本交叉污染、人工操作失误等因素导致假阳性出现，加上国产试剂、检测仪器的可靠性及稳定性较差，也难以确保检测结果的可靠性和准确性。目前除了提高国产试剂的特异性，还必须建立完善的检测程序。
3. 全自动化操作  NAT操作步骤较复杂，影响因素较多，对操作人员的技能要求较高。采用全自动核酸提取、扩增检测，缩短检测时间短，提高检测效率，便于质控，也有利于进行大样本量的筛查。目前我国核酸提取设备多为半自动化操作，提取效率较差，尚未在国内采供血机构广泛应用，现阶段除了引进国外成熟的NAT技术，还应该对核酸提取、扩增检测的整个流程进行优化，缩短检测时间，提高检测效率，建立一套适合我国国情的血液核酸自动化提取、扩增检测系统。
4. 质量控制  核酸检测对实验室条件的要求较高，需要规范化场所和高素质的操作人员。样本的制备、检测整个流程需要有防污染措施，对整个反应系统进行内外质控。
小     结
当前我国HBV感染情况严峻，每年报告乙型肝炎新发病例数约为50万，而目前所采用的ELISA法筛查HBsAg，存在较大的漏检率，为保障血液安全，预防输血感染HBV，应尽快考虑在血液常规筛查中增加NAT检测。