江南秋

　在功能基因组学研究中，阐明各种蛋白的结构和生物学功能是其核心任务，这不仅是生物学的主要研究方向，而且也是医学研究的主要内容，毕竟细胞的功能和表型是由细胞中的蛋白来主导的，许多疾病都是蛋白结构与功能、表达水平与调节的异常引起的。研究蛋白的功能，常常通过改变蛋白的表达水平，观察细胞的生物学特性的变化来实现。这种研究策略包括强制性地升高特定蛋白的表达水平，也包括蛋白表达水平的缺失。研究表明，在功能基因组研究中，功能缺失策略具有特殊重要地位。
　　1. 基因功能缺失的研究策略：基因功能缺失的研究策略主要包括以下几个方面。(1)反义寡脱氧核糖核酸（ODN）和反义RNA（antisense RNA）：反义分子包括反义ODN和反义RNA等。反义技术是指反义DNA或反义RNA分子作用及其机制研究的技术。它是通过以碱基互补配对方式结合，抑制、封闭或破坏目的基因结构及其表达的核酸分子，利用反义技术可了解特定基因的功能，同样也可利用反义技术抑制封闭某些有害或致病基因的表达。(2)核酶：核酶是一类独特的RNA分子，具有自我剪切和催化功能，以其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶RNA，抑制基因表达，特别是抑制某些有害基因表达。到目前为止，至少提出三种不同的核酶活性中心的结构形式，它们分别是锤头状、发夹状和斧头状结构。这三种主要类型的核酶RNA分子，其基本构成都是由活性中心及其侧翼序列组成，核酶RNA的活性中心决定了酶的催化活性，其侧翼序列决定了核酶RNA结合与裂解靶RNA的特异性。(3) 基因敲除：基因敲除（knock-out）模型是目前功能缺失研究策略中的主要技术途径之一。建立基因敲除的动物模型，基本上通过两种策略：一种是体外构建同源重组或基因打靶（gene targetting）的表达载体，利用受精卵细胞核微注射的方法，依靠受精卵细胞内的基因同源重组，实现基因敲除。这一策略的缺点就是效率太低。随着体细胞核移植技术即克隆动物模型技术的研究进展，目前采用体外构建同源重组或基因打靶载体，在体外条件下对于实现同源重组的细胞系进行选择鉴定，然后进行体细胞核移植，这是基因敲除模型发展的主流技术方向。基因敲除是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计，将该基因去除，或用其它相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。(4)显负性突变体策略：蛋白以及蛋白之间的相互作用决定了蛋白的生物学功能及细胞的表型。一种结构发生变化而失去其正常的生物学功能的蛋白质分子，往往与其相应的野生型蛋白进行竞争性的抑制，从而阻断野生型蛋白的生物学功能。这种具有竞争性抑制野生型蛋白分子生物学功能的突变体称为显负性突变体（dominant negative mutant）。显负性突变体在生物学研究中具有广泛的应用前景。(5)RNA干扰技术。
　　2. RNA干扰的机制与策略：1995年Guo等在研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）的par1基因功能时，将par1基因的反义RNA表达载体导入到秀丽隐杆线虫中，引起par1基因的缺陷现象，同时发现导入par1基因的有义链基因进行表达时，也产生了par1基因的缺陷现象，表明反义和正义RNA的表达都有类似的抑制效应，但是机制却明显不同。Fire等对这一现象的机制进行了细致深入的研究，比较了反义RNA、正义RNA和双连RNA（dsRNA）在秀丽隐杆线虫中的抑制效应，发现dsRNA产生至少有10倍以上的抑制靶基因表达的效果，并将dsRNA抑制同源基因表达的现象称为RNA干扰，从此RNA干扰现象得到了空前的重视，并在各种病原微生物的基因表达抑制方面进行了许多有益的尝试。干扰RNA是生物系统在长期进化过程中形成、天然存在的防御机制之一，从低等生物到高等生物都普遍存在。当一种生物系统受到异源性病原体的入侵时，可以自动开启属于RNaseⅢ的核糖核酸酶，即RNA切割酶（dicer），将入侵病原体的RNA成分切割处理成21～25nt的RNA小片段，发挥RNA干扰（RNAi）的抑制性生物学作用，参与构筑生物系统的防御机制。
　　3. RNA干扰的机制与策略在肝脏疾病相关基因调控研究中的应用：RNAi能迅速而方便地使某个基因失去功能。因而，能更快的决定基因与表型的关系。RNAi技术还具有的一个优势是能同时对多个基因或基因家族进行研究，或应用于研究mRNA差别剪接形成的异构体，甚至在基因组水平上构建针对基因组的RNAi表达载体，对于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查，具有更大的优势。相对于基因敲除技术长期抑制基因功能，RNAi技术仅仅是使基因表达暂时降低或抑制，基因组的信息仍是完整的。利用RNA干扰技术先封闭基因的表达，然后再激活，通过前后基因表型的变化，能很方便的鉴定出基因的功能。在进行反向遗传学研究时，RNA干扰技术也能用来寻找药物治疗靶点，Makimura等利用RNAi技术减少了丘脑下部AGRP基因50%的表达量，AGRP使代谢率提高而不用减少摄食量，从而减轻肥胖，为肥胖的治疗提供了一个靶点。用于疾病机制研究，在鼠模型中，利用RNAi技术干扰Fas通路能明显降低自身免疫性肝炎引起的肝功能衰竭和纤维化程度，说明Fas通路在肝脏疾病中有重要作用。Jean等研究表明，在培养的HeLa细胞中分别转入反义ODN和siRNA，结果siRNA比ODN能更有效的抑制基因表达；在异种移植的小鼠中进行实验表明siRNA在体内能抑制基因表达，但ODN因其对RNA酶的低抵抗性而不能引起有效的基因表达抑制。RNAi技术能使特异的基因封闭，阻止病原体的繁殖或致病基因的表达，为临床治疗此类疾病提供了一种新的可能的方法。RNA干扰只能抑制同源基因的表达，具有较高的特异性，因此能减少非特异作用引起的不良反应。目前的研究主要集中在病毒性疾病和肿瘤性疾病。
　　在肿瘤的综合治疗中，基因治疗日益受到重视。肿瘤是一种多基因疾病，针对单个基因的基因治疗一般不能取得好的效果，RNA干扰技术可以针对多个基因或基因族的共有序列来抑制多个基因的表达，从而能更有效的抑制肿瘤生长。针对慢性粒细胞白血病的融合基因，设计的小干扰RNA，能够明显地促进白血病细胞凋亡，显示了良好的治疗作用。Cioca等利用粒细胞白血病细胞系研究了Raf-1和 Bcl-2基因在疾病中的作用，表明RNA干扰能诱导凋亡并能提高细胞对化学治疗的敏感性。血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤的发生发展中起着重要作用，已成为肿瘤治疗的新靶点。Zhang等利用DNA表达载体来合成鼠VEGF不同异构体的dsRNA，特异性的封闭了大分子量VEGF的表达，有效地抑制肿瘤的生长。APC 基因是Wnt 信号通路中的重要组分，突变后引起细胞增殖，在肿瘤的发生中起重要作用；Verma等利用RNA干扰技术使这两个基因表达降低，在细胞和裸鼠中都能抑制肿瘤细胞的增殖。以erbB1、端粒酶为靶点，利用RNA干扰技术治疗肿瘤的研究都取得了满意的结果。

江南秋

　近年来，RNA干扰（RNAi）技术已成为癌症基因治疗中令人关注的研究热点，以其高效、特异、应用广泛的特点，展示了诱人的临床应用前景。
　　RNAi是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制。RNAi技术有3个重要的特点，首先它具有高效性。从刚开始的21～23nt的小干扰RNA（siRNA）分子，到后来研究应用的27～29nt的小发夹RNA（shRNA）分子，RNAi都具有高效抑制作用，抑制率均在90%以上。其二，RNAi有严格的序列特异性。针对变异基因设计的siRNA或shRNA分子抑制异常基因，而正常基因不受影响。其三，siRNA具有高度的稳定性。它是3′端悬挂TT碱基的双链RNA，化学性质很稳定，不需要修饰。如果加入一个6nt环（loop）的shRNA，则更进一步增加其稳定性和高效性。
　　众所周知，很多原因可以促进肝癌的发生，如乙型或丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素、饮用水中的藻类毒素、亚硝胺盐等，这些因素可以使基因产生变异，如点突变、插入、缺失、拷贝数增加、基因易位或重排等，造成癌基因激活和（或）抑癌基因的失活，使细胞无限制生长，从而产生肿瘤。
　　目前，RNAi的研究已进入动物实验阶段，已经通过质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及慢病毒等载体将RNAi试用于治疗病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等。在我国征服严重急性呼吸综合征（SARS）的战役中，发挥了重要作用。理论上，RNAi可应用于癌症发生、发展和转移过程中任何有基因异常高表达的环节。在肝癌治疗领域中，体现在以下几个方面：(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因，很显然它是此方面的理想武器。基于RNAi的高度特异性，尽管突变基因与野生型基因通常只存在一个碱基的不同，RNAi仍可以对突变基因产生抑制作用，而对正常细胞中的野生型基因不产生抑制作用。(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达。(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。基因扩增是指原癌基因通过某种机制在原来染色体上复制出多个拷贝数，导致表达产物异常增多，细胞增殖。设计针对基因扩增中起重要作用基因siRNA或shRNA，可以抑制目的基因表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。(4)RNAi可应用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因的表达，如肿瘤多药耐药基因。(5)RNAi同样可针对血管生成因子及其受体。(6)等位基因特异性抑制(ASI)。ASI是一针对肿瘤细胞中与缺陷基因对应的正常等位基因进行治疗的方法，其前提是该等位基因属杂合子并且是细胞生命活动所必需的。抑制了正常等位基因的肿瘤细胞会死亡，而正常细胞由于等位基因的代偿而不受影响。
　　鉴于RNAi在动物实验中的出色表现，已有不少研究者试图将其应用于临床。但仍存在一些亟待解决的问题：(1)给药途径：基因治疗往往面临转染效率不高的问题，RNAi也不例外。目前的转染途径——脂质体和电穿孔法远远不能满足临床的要求，因此应用临床需要大大提高转染效率。一般用病毒作为载体将生成siRNA的基因运送到细胞中，然后这些基因就在细胞内大量生产siRNA，让目标基因沉默。由于病毒载体可能引起有害的免疫反应，这种方法比直接注射siRNA具有更大的风险，因此开发具有高转染效率、高基因容量和较低毒性的新型载体是RNAi技术应用于临床面临的一大难题。非载体直接注射siRNA也是一种途径，但是较之载体途径存在效率低、持续时间短、成本高的问题。不管是载体还是非载体的方式，通过瘤内注射，或经导管注射可以将基因沉默的药物准确送入特定组织。(2)作用时间：肝癌的治疗一般首选手术，但大部分肝癌确诊时已到晚期，失去手术时机，介入、瘤内注射酒精、射频等姑息治疗疗效有限，RNAi可以弥补这些缺陷。以后的研究可针对发展新的基因表达系统，使RNAi发挥作用时间及其持续时间可调控。(3)安全性：目前RNAi的研究已进入动物模型阶段，其结果令人鼓舞，但是仍需进一步加强动物模型研究，从中总结经验，仔细设计临床试验，确保应用的安全高效。(4)解决多基因治疗：肿瘤的发生是多基因改变多因素协同作用的结果。目前的研究多针对单个基因，因此，RNAi研究者需要努力解决这方面的问题。(5)经费问题也是RNAi应用于临床必须面对的问题。随着RNAi研究的升温，已有不少大公司出售RNAi试剂盒，较之以前已经大大降低了费用。但是仍需进一步发展新的方法，降低成本，为RNAi的普遍应用提供前提。
　　目前，国际一些知名公司如美国的Alnylam公司、Sirna公司及Intradigm公司等，已经开始解决以上问题。Intradigm和德国的Ribopharma两家公司已经宣布将在3年之内进行RNAi药物的临床试验。相信对RNAi的研究热情将促使RNAi药物以很快的速度进入临床试验阶段，大规模的应用包括肝癌在内的临床肿瘤治疗已为时不远。

江南秋

　RNA干扰（RNAi）是由小双链RNA有效地作用于同源RNA序列，经细胞内核酸酶作用使同源序列降解的过程。虽然最初的研究是观察其对细胞基因的下调作用，近来的一些研究表明RNAi在抗肝炎病毒等人类和动物病毒中也同样有效，所以RNAi有可能发展成为一个新的抗肝炎病毒治疗的方法。
　　1. RNAi的载体与给药方法：在RNAi抗肝炎病毒的研究中，所用RNAi包括合成的小干扰RNA（siRNAs）和质粒依赖的siRNA表达体系。两种方法均较为有效，前者仅能获得瞬时抑制，后者的抑制作用则较为持久。两者距临床应用都还有一定距离。
　　2. 抗丙型肝炎病毒：RNAi抗肝炎病毒最早的成功研究是抗丙型肝炎病毒（HCV）。HCV基因组的5′端非编码区（5′UTR）高度保守，调节病毒的复制与蛋白表达，HCV非结构基因（NS）5b编码的RNA依赖的RNA聚合酶与NS3、NS4a蛋白组成复制酶复合体，以病毒基因组为模板复制出负链RNA，进而复制出新的正链。抗HCV的RNAi都以上面的几个基因区为靶基因。又因为siRNA和靶基因之间的单个碱基错配都会影响RNAi的效率，所以，HCV保守的5′UTR 是RNAi沉寂HCV最理想的靶位。研究RNAi抗HCV的6个研究小组观察了9条siRNA的作用，其中4条以HCV 5′UTR为靶基因，3条以HCV NS5b为靶基因。RNAi抗HCV的研究主要以细胞模型为主，目前研究HCV复制最有效的细胞模型是含有HCV复制子的Huh-7细胞，RNAi在细胞水平抗HCV的研究都以此为模型。以HCV 5′UTR为靶位的siRNA在转染后12、96h分别使HCV复制效率降低5倍和80倍，在转染Huh-7细胞2d后，以HCV NS3为靶位的siRNA可以抑制HCV复制达5.7倍，而针对NS5b的siRNA抑制效率达8.3倍，为干扰素对复制子抑制效率的3倍。若以质粒依赖的siRNA同时表达有意义链和反义链，在转染3d后仍能保持70%的抑制效率。惟一的在体研究以鼠为模型，化学合成与质粒依赖的siRNA对HCV复制抑制效率可分别达到75%和98%。显示了质粒依赖siRNA抗HCV复制应用于临床的巨大潜力。
　　3. 抗乙型肝炎病毒：有7个研究小组分别研究了以乙型肝炎病毒（HBV）表面（S）基因、核心（C）基因、前C基因和X基因为靶位的siRNA作用，抑制效率达42%～78%，鼠模型在体研究中以S基因和C基因为靶位的siRNA可使HBV表面抗原和e抗原降低至1/3。特别是S基因区的siRNA持续抑制达11d，而C基因区siRNA的抑制效率仅持续3～5d。
　　4. 抗丁型肝炎病毒：有限的RNAi抗丁型肝炎病毒（HDV）研究发现，HDV RNA的基因与反基因均对RNAi有抵抗。
　　5. RNAi对干扰素通路的活化：RNAi在抗肝炎病毒作用中的另一个机制是能够活化干扰素通路，非特异地减弱病毒蛋白的合成和RNA降解。更能使2′、5′寡腺苷酸合成酶的活性增高500倍。
　　6. RNAi抗肝炎病毒的潜在意义：在抑制HBV复制研究中最有意义的结果是：RNAi除了有效抑制活跃复制的HBV，还能抑制非活跃复制的HBV，这一点不同于核苷类似物，因此，有可能发展成为与拉米夫定、阿德福韦等核苷类似物作用机制和位点不同的抗HBV药物联合用药。RNAi不能达到对病毒复制的完全抑制，限制了其作为单剂用药的可能性，因此，今后抗肝炎病毒的作用可能定位在与其它药物的联合用药与辅助用药中。但是，与其抗肝炎病毒治疗的应用并不矛盾，因为，抗生素在细菌感染中的应用经验表明，对不同靶点的药物联合作用将显著提高抗微生物的效果。同时，RNAi本身可以通过对多靶位的联合作用进一步提高抑制效率。RNAi发挥作用依赖于与靶序列完全同源，也需要多靶位RNAi联合应用，避免单个RNAi在病毒变异时失去作用。
　　7. 面临的问题：(1)RNAi作用的生物环境：在siRNA取得最显著抑制效率的抗HCV研究中，多以复制子为研究模型。HCV复制子只能在Huh-7细胞中复制，而在别的细胞中则很困难，提示Huh-7细胞中含有其它肝细胞株不存在的元件支持HCV复制（虽然现在还没有发现或认识到这些元件）。同样，含有复制子的Huh-7细胞可能拥有RNAi作用所必需的功能元件，而在正常感染状态下，受HCV感染的人肝细胞是否具有这些必需元件或者HCV将抑制RNAi的作用还需要明确。(2)肝炎病毒的特性：对HBV基因区的选择还未能明确最有效的靶基因区，并且还有一些非特异的抑制作用。因为HBV共价闭合环状DNA位于细胞核中，而RNAi难以进入细胞核，因此，RNAi抗HBV作用不可能从根本上改变现行抗HBV治疗的效果。(3)药物靶向问题：RNAi干扰的给药方式和药物靶向问题还需要充分研究，加以解决。(4)可能出现耐药：RNAi严格遵循碱基互补原则，单个碱基的错配即可显著降低其抑制效率。肝炎病毒中，特别是HCV易于变异，在RNAi不能完全抑制病毒的基础上，单个碱基的变异即可使残留的低负荷病毒很快逃逸RNAi的作用，重新活跃复制。