乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA检测分析
刘 伟，赵伟，罗 婵，曾文权
(东南大学医学院附属南京第二医院，江苏南京210003)
临床肝胆病杂志2005年21卷第一期
收稿日期~2004—01—29 修订日期：2004—03一l8
作者简介：刘伟(1964)，男，40岁，副主任医师，硕士生，主要从事肝病发病机理研究。
【摘要】探讨乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA的相关性。采用免疫荧光定量聚合酶链和原位分子杂交技术分别检测随机选择的40例乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA。乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA水平呈正相关，但不呈直线相关(re=0．24，t=1．09，P>0．05)。乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV—DNA水平有相关性。可以通过检测乙型肝炎患者血清HBV—DNA来判断其肝组织中HBV复制水平。
【关键词】乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸；血清；肝；相关性
近年来随着原位分子杂交和定量PCR方法的建立，使我们能够定量观测乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA水平。为了探讨慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA的相关性，我们采用这两种方法，对慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA进行了如下的研究。
1 资料与方法
1．1 病例收集随机选择我院住院的40例慢性乙型肝炎患者，其中轻度慢性肝炎8例，中度慢性肝炎26例，重度慢性肝炎6例；男24例，女16例，年龄18～ 60岁，平均32．4岁。所有病例近3个月未使用过特殊抗病毒药物，如干扰素、拉米夫定、胸腺素a—等。收集外周血，分离血清，当天检测或置一20℃保存待检。由专人操作。
1．2 血清HBV—DNA检测 采用实时荧光定量PCR法。肝穿刺活检前2—3天，抽静脉血用美国Roche诊断有限公司生产的LightCyclerTM荧光定量PCR仪，采用AmpliSensor PCR定量方法检测慢性肝炎患者血清HBVDNA。HBVDNA荧光检测试剂盒由深圳匹基生物技术开发有限公司提供。检测灵敏度为1>500copies／ml。
1．3 肝组织HBV—DNA检测 采用肝穿刺活检法，取肝组织，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，组织切片，脱蜡水化，蒸馏水冲洗，37度温箱烘干，蛋白酶tc(20txg／m1)室温下消化30min，脱水，37℃温箱烘干，加生物素标记的HBVDNA探针，加盖玻片，加热(95℃)10min(变性)，放人孵育盆进37℃温箱过夜，加蛋白阻断液，37℃温箱5min，滴加羊抗鼠生物素IgG ，37度孵育20min，37~C的增强洗液冲洗，甩干；加Goat Anti Mouse I ，37~C孵育20min，37~C的增强洗液中洗，甩干；加入碱性磷酸酶标记的结合物(sAP)，37℃孵育20min，37℃的增强洗液冲洗，甩干；加入BCIP／NBT染色，蒸馏水冲洗，复染封片。HBVDNA kit和HBVDNA探针由福建迈新公司提供。肝穿刺活检指征：TBil<85．5ptmoL／L；PTA>60％；B超或者CT排除肝脏血管性疾患。
1．4 诊断标准病毒性肝炎诊断标准根据2000年西安学术会议修订的诊断标准。原位分子杂交诊断标准为半定量诊断标准：计数任选5个高倍视野(×400)中的HBVDNA颗粒的平均值(N)，0<N≤10为“ +”；10<N~<20为“++”；20<N≤30为“+++”；30<N为“++++”。
1．5 统计学处理采用非线性最小二乘法，曲线拟合，求相关系数r，再作t检验(SAS 8．0)。
2 结果
40例慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中HBVDNA检测结果见表1。血清和肝组织中HBVDNA水平呈正相关，但不足直线相关(re=0．24，t=1．09，P>0．05)。
表1 血清和肝组织中HBVDNA(QTY／~)的检测结果
此主题相关图片如下：
QrY：血清HBVDNA测定值的常规对数值。
3 讨论
血清HBVDNA定量PeR法可真实反映乙型肝炎病毒(hepatitis virus B，HBV)感染、复制及病程变化。我们采用的mplisensor PCR定量方法融会了PeR技术和DNA探针技术的优点，该方法具有高度的敏感性和特异性，整个过程均属闭管操作，免除了传统方法的电泳检测等后处理过程，使PCR污染机会降至最低成为可能，其实验检测结果可靠。
对慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中HBVDNA相关性进行的研究，目前还鲜见报道。本研究显示：乙型肝炎患者血清和肝组织中HBVDNA水平呈正相关，但不呈直线相关(re=0．24，t=1．09，P>0．05)。本研究说明：在临床上动态检测慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷，有利于了解其肝组织中HBVDNA负荷的变化；但是由于乙型肝炎患者血清和肝组织中HBVDNA水平不呈直线相关，所以不能通过慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷水平来妄加推测其肝组织中HBVDNA负荷水平。
HBVDNA是病毒复制和传染性的直接标志。HBVDNA负荷水平测定对于判断乙型肝炎病毒复制程度、传染性大小，抗病毒药物疗效，病情变化和预后，为调整抗病毒药物剂量、确定疗程，可以提供可靠依据。本研究说明：在临床上可以通过动态检测慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷来了解其肝组织中HBV DNA负荷的变化；但不能通过慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷，来妄加推测其肝组织中HBVDNA负荷；要准确了解慢性乙型肝炎患者组织中HBVDNA负荷水平，判断乙型肝炎病毒在肝内的复制程度和调整抗病毒药物剂量，必须测定其肝组织中HBVDNA负荷水平，因为我们临床上要对付的主要是造成肝组织损伤的肝内乙型肝炎病毒。
[参考文献]
略
