拉米夫定治疗乙型肝炎病毒B、C基因型疗效比较研究
研究乙型肝炎病毒（HBV）基因型对拉米夫定抗病毒疗效的影响。 方法 回顾调查235例拉米夫定治疗组和对照组患者的临床资料。 结果 135例患者接受拉米夫定抗病毒治疗，对照组100例。HBV优势基因型是B型和C型，拉米夫定治疗组有效率分别为92.9%和75.9%（χ2＝6.628，P<0.05），对照组有效率分别为9.8%和8.5%（P>0.05）；YMDD变异发生率治疗组为3.6%和16.5%（χ2＝5.508，P<0.01）。结果发现，B基因型、丙氨酸氨基转移酶升高、HBV DNA低水平是抗病毒应答预测因素。 结论 B基因型HBV对拉米夫定的应答率优于C型，YMDD变异发生率低于C型，基因型是影响拉米夫定疗效和决定变异的重要因素之一。拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者临床特点
现对63例慢性乙型肝炎患者进行了HBV YMDD变异检测，比较分析YMDD变异型耐药与非YMDD变异型耐药的临床特点。9t(b,D l`.U _7x"~)o"C一、资料与方法p H#V*\#y&{9d}C
1. 病例选择：2000年1月～2003年2月浙江大学医学院附属第一医院和附属邵逸夫医院用拉米夫定抗HBV治疗的慢性乙型肝炎患者63例，男47例，女16例，包括以下情况：(1)血清HBV DNA经拉米夫定治疗后滴度下降而转阴，但随着治疗时间的延长出现血清HBV DNA 反跳61例；(2)在拉米夫定治疗1年或1年以上，血清HBV DNA始终未转阴2例。以上情况考虑存在HBV 耐药基因变异，诊断标准参照文献[1]。
2. 病毒学指标与肝功能检测：治疗前及治疗中进行病毒学标志和肝功能检测。HBV DNA采用Lightcycle荧光仪定量检测，试剂由罗氏公司提供。用酶联免疫吸附试验检测HBV血清免疫学标记物，并排除其他病毒学标志阳性。肝功能检测指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）正常值<40U/L，总胆红素（TBil）正常值<17.1μmol/L，并排除其他原因引起的肝功能异常。
3. YMDD变异检测：(1)PCR扩增产物直接用全自动测序仪检测HBV YMDD变异。测序引物序列为：P1（252～272） 5′-AGACTCGTGTGGACTTCTCT-3′，P2（818～840）5′-GGTTCAAATGTATACCCAAAGAC-3′，P3 5′-CCTACGGATGGAAATTGCA C-3′。引物由上海生物工程公司合成。(2)PCR产物的限制性片段多态性技术分析：引物为：P2 5′-AACCTTCGGACGGAAACTGC-3′，P4 5′-CTGGATCCAGGGTTTAAATGTATACCC-3′，P5 5′-TGGAATTCACCTGTATTCCCATCCCAT-3′，P6 5′- CAGACTTGGCCCCCAATACCACATCGTGCA-3′，P3 5′ -TTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTAATAT-3′。限制性内切酶FokⅠ、SspⅠ、Alw441购于上海生物工程公司。
4. 统计学处理：组间率的比较采用χ2检验。
二、结果
1. 慢性乙型肝炎耐拉米夫定患者的YMDD变异发生情况：63例慢性乙型肝炎患者耐拉米夫定经过测序，28例患者测得YMDD变异，占44.4%，其中YIDD变异10例，YVDD变异14例，YI/MDD变异1例，YI/VDD混合变异3例。其他35例患者虽然为耐拉米夫定，但YMDD区域并未发现变异。2例慢性乙型肝炎患者经拉米夫定治疗1年HBV DNA始终未转阴2例，其中1例为YIDD变异，1例非YMDD变异。 p5O"G kSG p
2. YMDD变异组与非YMDD变异组的HBV DNA滴度比较：YMDD变异组有75.0%（21/28）和非YMDD变异组有54.3%（19/35）患者的血清HBV DNA滴度一半以上者均集中在105～107拷贝/ml之间，为中等滴度。YMDD变异组有10.7%（3/28）和非YMDD变异组有11.4%（4/35）患者的血清HBV DNA大于107拷贝/ml，甚至108拷贝/ml和109拷贝/ml，YMDD变异组有17.9%（5/28）和非YMDD变异组有34.3%（12/35）患者的血清HBV DNA滴度<105拷贝/ml，两组的HBV DNA滴度构成比差异无显著性(χ2＝2.29，P>0.05)。
3. 两组患者病情分析：发生耐拉米夫定后，YMDD变异组有82.1%（23/28）和非YMDD变异组有77.1%（27/35）患者表现为慢性乙型肝炎轻度发作，即肝功能表现1项或2项异常，主要为ALT异常，无明显乏力、纳差、腹胀等。YMDD变异组有7.1%（2/28）和非YMDD变异组有11.4%（4/35）患者病情出现进行性进展，表现为重度发作，总胆红素大于85.5μmol/L,出现肝功能失代偿表现，这些患者的HBV DNA滴度都为>107拷贝/ml。YMDD变异组有10.7%（3/28）和非YMDD组有11.4%（4/35）患者表现为慢性乙型肝炎中度发作。两组患者的临床表现无明显差别（χ2＝0.54，P>0.05）。
拉米夫定抑制乙型肝炎病毒X基因的转录与表达
乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白在HBV相关性肝癌的发生中有着重要作用，本研究旨在探讨拉米夫定对HBV X基因复制、转录及表达水平的影响。 方法 用聚合酶链反应法检测拉米夫定对转染X基因复制的影响，用逆转录-聚合酶链反应法检测拉米夫定对转染X基因mRNA的影响，用生物分子相互作用系统检测拉米夫定对X蛋白表达的影响，探讨了拉米夫定作用的量效和时效关系。 结果 拉米夫定组与对照组HBV X基因复制的目的基因条带吸光度（A）值分别是151.4±3.5和144.0±11.4，差异无统计学意义。4.36×10-4mol/L拉米夫定持续作用24h能完全抑制X基因的转录，对照组与治疗组（16h）目的条带的A值分别为243.9±9.0和133.2±7.8，P<0.01，其抑制效应随药物浓度增加和作用时间延长而增强。4.36×10-4mol/L拉米夫定持续作用16h，使代表X蛋白表达的最大结合量值从353.3±15.9降至252.3±18.8，P<0.01。结论 拉米夫定不影响HepG2x中转染的X基因复制，但对X基因的转录和蛋白表达有明显抑制作用。作者单位：400016 重庆医科大学生殖医学系生殖生理学教研室（谢怡）；重庆医科大学病毒性肝炎研究所（刘杞）；成都，四川大学华西医院人类疾病相关多肽研究室（王春晖、唐承薇）
通讯作者：唐承薇，成都，四川大学华西医院人类疾病相关多肽研究室，610041
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