[RNA干扰专栏] 感觉还可以的几篇文章：：：
检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达，构建针对人肝再生增强因子基因编码区的小干扰RNA（siRNA）表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B，观察其对人肝再生增强因子表达的影响。 方法 用免疫细胞化学法观察HepG2细胞表达hALR的情况。将构建成功的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞，转染后48h，用免疫细胞化学法及逆转录聚合酶链反应法观察人肝再生增强因子蛋白及mRNA的表达。 结果 HepG2细胞有人肝再生增强因子的表达。成功构建了针对人肝再生增强因子基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A，并发现它能明显抑制人肝再生增强因子的表达，而随机序列的siRNA却无此作用。 结论 人肝再生增强因子的siRNA具有明显和特异性的抑制人肝再生增强因子的表达作用。端粒酶逆转录酶小干扰RNA对肝癌细胞的体外抑制作用
研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的小干扰RNA（siRNA）在肝癌细胞SMMC-7721中抗肿瘤作用。 方法 针对hTERT基因编码区及非编码区，采用T7转录系统在体外合成了2条siRNA，转染SMMC-7721细胞。以四甲基偶氮唑盐试验、逆转录聚合酶链反应及western blot观察其对SMMC-7721细胞增殖、hTERT mRNA及蛋白表达的影响。 结果 2条siRNA以剂量依赖性方式抑制了SMMC-7721细胞增殖，当给药浓度为100nmol/L时，对hTERT mRNA及蛋白表达有明显的抑制作用。 结论 靶向hTERT的siRNA对hTERT基因表达有抑制效果，有可能发展为一种新的抗肿瘤药物。抗结缔组织生长因子小干扰RNA对肝星状细胞合成分泌细胞外基质的影响
研究化学合成抗结缔组织生长因子(CTGF)小干扰RNA（siRNA）对肝星状细胞（HSC）CTGF基因表达及合成分泌细胞外基质（ECM）的影响。 方法 将化学合成抗CTGF siRNA以Oligofectamine包裹，转染HSC T6细胞，设空白对照，抽提孵育24、48、72h细胞总RNA及蛋白质，并收集培养上清液，应用western blot和（或）逆转录聚合酶链反应检测HSC T6细胞CTGF及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达，应用放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。 结果 与空白对照相比，转染siRNA的HSC T6细胞CTGF及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达水平显著下调，培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量24、48、72h分别降低46%±7%, 52%±7%, 53%±7% (F＝157.45，P＝0.0001)和29%±18%，29%±7%, 27%±5% (F＝10.77, P＝0.0079)。 结论 化学合成抗CTGF siRNA能高效抑制HSC CTGF基因表达，显著减少HSCⅠ、Ⅲ型胶原及透明质酸等ECM的合成与分泌，抑制效应可持续72h，提示化学合成CTGF siRNA具有预防及治疗肝纤维化的潜力并具有极好的开发前景。RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究
以乙型肝炎病毒（HBV）核心区为靶位，构建表达小干扰RNA（siRNA）的质粒载体pSilencer3.1-H1hygro，体外观察siRNA抗HBV的效果。 方法 以HepG2 2.2.15细胞为靶细胞，利用脂质体Metafectene与表达siRNA的质粒载体pSilencer3.1-H1hygro共转染，用定量聚合酶链反应检测细胞上清液中DNA，用逆转录聚合酶链反应检测HBV C-mRNA。 结果 成功构建了表达siRNA的转录质粒载体，两条siRNA均可抑制HBV的复制，而且与siRNA浓度成正相关。 结论 靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV的复制。RNA干扰技术用于抗乙型肝炎病毒的实验研究
构建针对乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和核心抗原的小干扰RNA（siRNA）表达载体pSuper-C，观察其对HepG2 2.2.15细胞（简称2.2.15细胞）中HBV DNA转录和翻译相应蛋白的影响。 方法 根据RNA干扰（RNAi）作用原理设计针对HBV核心区的相应序列，再将其克隆入含聚合酶Ⅲ H1-RNA启动子的真核表达载体pSuper，将此重组质粒以电转染法转入2.2.15细胞中，用酶联免疫吸附法（Abbott试剂）检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。 结果 经酶切鉴定、电泳和测序分析证明，成功构建了含作用序列的重组质粒pSuper－C；但以电穿孔法转染 2.2.15细胞后未能发现其对2.2.15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。 结论 RNAi在2.2.15细胞中的作用还需进一步的实验来证实。载体法筛选乙型肝炎病毒S基因小干扰RNA靶位体系的建立
构建4个针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因序列的小发夹RNA (shRNA)表达载体，作用于增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和HBV S基因融合表达载体，观察shRNA对融合蛋白的抑制作用，筛选出有效靶位。 方法 利用pAVU6＋27质粒，设计并构建4个shRNA表达载体，与融合表达载体共转染AD293细胞，荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况并通过流式细胞仪分析shRNA对融合蛋白的抑制作用。同时，逆转录聚合酶链反应法验证其筛选的有效性。 结果 成功构建shRNA表达载体和HBs-EGFP融合表达载体；4组shRNA表达载体均可不同程度抑制融合基因的表达，其中以579位点最有效，荧光表达抑制率为69.8%，RNA水平抑制率为74.6%。 结论 筛选出有效抑制HBV S基因的siRNA靶位。RNA干扰技术用于肝病治疗的研究
近年来，病毒性肝炎的治疗研究有了长足的进展，特别是干扰素和抗病毒核苷类药物不断有新的发现，但其疗效仍有不尽人意之处。随着人类基因组计划的完成，基因治疗的领域不断拓展，抗病毒性肝炎及相关肝病的基因治疗研究又有了相应的发展，其中RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的出现为病毒性肝炎抗病毒治疗研究提供了新的选择。所谓RNAi技术，是指利用21～23bp长双链RNA（double strand RNA，dsRNA）诱导与其有同源序列的mRNA降解的过程。此过程首先利用特定长度的寡核苷酸与酶蛋白形成复合体，然后利用互补识别过程与靶序列结合，再由酶蛋白对靶序列离3′端约12bp处发生酶切作用从而破坏mRNA，达到阻止相应基因表达的目的。整个RNAi过程主要有以下两步骤：(1)dsRNA被切割酶剪切为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；(2)siRNA与酶蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC再与靶mRNA结合，利用酶切作用破坏mRNA。由于RNAi作用具有序列特异性，最终破坏的是mRNA，因此它主要被用于两个方面：反向功能基因组学研究和抗病毒研究。与同源基因重组、反义寡核苷酸和核酶等技术相比，RNAi技术更方便、经济和快速。因此，自其问世以来就迅速和大量地被用于研究从线虫到人类的基因，并取得了不菲的成绩。RNAi最初就被证明是植物抗病毒的基本手段。而当其在哺乳动物细胞中也被证实存在以后，就迅速地被用于抗病毒治疗研究[1]。要利用RNAi进行研究，首先必须获取siRNA。目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：化学合成 、体外转录 、长片断dsRNAs经RNA酶Ⅲ类降解、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs、聚合酶链反应（PCR）制备的siRNA表达框在细胞中表达。前3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞，后2种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中[2, 3]。
对于乙型肝炎病毒（HBV），Hamasaki等[4]以体外人工合成siRNA，Shlomai等[5]所用的siRNA则由载体pSuper携带相应序列在胞内表达，McCaffrey等[6]所用的siRNA来源于含人U6启动子的表达载体，分别于体外细胞模型和小鼠体内，在mRNA水平、蛋白质水平可检测到siRNA对靶基因的抑制作用。对于丙型肝炎病毒（HCV），McCaffrey等[6]首先证实了RNAi技术在小鼠体内是可行的；Seo等[7]以具有HCV亚基因复制子的Huh-7为细胞模型，发现靶蛋白表达呈剂量依赖型的下降；Wilson等[8]通过HCV感染细胞模型AB12-A2，检测了6个siRNA分子的作用，结果发现不同分子有迥异的表现，同时也证明通过载体表达的siRNA分子可以比直接转染体外化学合成的siRNA分子有更长的作用时间。
包括HBV和HCV在内，因RNAi现象发现以来，RNAi用于抗病毒研究国内外已有较多报道，使人们不难认可其用于抗病毒治疗的有效性及应用前景。模拟病毒对siRNA的良好反应说明在进化过程中，要么RNAi未能对病毒施加足够的抗病毒压力，要么病毒以某种手段逃避了RNAi的抗病毒压力。目前为止，尚无通过人体细胞内切割酶形成siRNA分子，达到抗病毒效应的报道。体外合成和胞内转录的siRNA能够发挥抗病毒作用，说明病毒可能是通过干扰siRNA的形成而逃避机体的免疫压力（例如破坏切割酶），而siRNA的体外合成和胞内转录则绕过了这一步骤。在确认RNAi的作用后，其第二步当然是找到具有最佳效果的siRNA作用靶序列。RNAi用于抗HBV治疗有如下优点：第一，它的作用具有序列特异性，且siRNA本身由于片段短，不会引起非特异性的细胞免疫反应。第二，HBV本身长约3200bp,有3.5kb、2.4kb、2.1kb、0.8kb 4种mRNA,可提供数百个RNAi的作用位点；但同时由于HBV的DNA聚合酶缺乏纠错能力，从而具有高度变异性。在选择siRNA的作用位点时首先应考虑保守区域，其次可同时使用多个位点，则可有效防止病毒变异株的出现。早先有研究者认为，siRNA的作用与靶序列的二级结构无关[9]。新近有研究结果表明，RNAi的作用是与其二级结构有关的。第三，RNAi的作用不依赖于病毒的复制，使得该技术可与现有抑制HBV复制的药物（如拉米夫定）联合应用。当然，与拉米夫定一样，RNAi技术也不能从体内清除共价闭合环状DNA。但利用此技术，或许可能建立起用于抗HBV的“鸡尾酒治疗法”。对HCV而言，其高度保守的5′端非翻译区和核心抗原区及NS5B是查找的重点。同样，同时应用针对多外靶序列的siRNA则可有效防止抗性变异株的出现。从理论上讲，任何siRNA分子，只要其对应靶序列不在调节蛋白结合区，都应是有效的。但也可以看到，多个研究小组设计了多个siRNA分子，这些分子对病毒的抑制效应却有明显的差别。究其原因，一方面RNAi的具体作用机制尚未完全清楚，另一方面考虑到机体与细胞内的复杂环境，RNAi的过程似乎也不应像理论上那么简单。RNAi要用于人体治疗，其药代动力学也是研究的重点。目前关于siRNA分子在胞内的有效时间长短不一，短则72h，长则21d。这种差别可能来自所选实验模型的差异，亦或是具体实验方法的不同。关于RNAi用于抗HBV、HCV的研究，目前多限于体外进行。要进一步有所突破，一方面，有必要在更接近人体，同时亦是病毒宿主的大动物模型（如黑猩猩）体内进行实验；另一方面，还需要解决如何安全有效地将siRNA或其表达载体导入人体，定位于肝脏细胞内的问题。
RNAi应用于抗病毒，特别是抗HBV、HCV的大量研究成果，让人们看到其重要的应用前景。本期所选用的几篇国内RNAi技术在肝病治疗中的研究报道，涉及病毒性肝炎、肝纤维化及肝癌等领域，已初步显示国内肝病研究对于RNAi这一新技术的重视。尽管目前仍有大量的问题尚未解决，如RNAi作用机制，进入体内的安全性等，但加强RNAi这一新技术的研究，为肝病治疗研究开拓了一全新的方向。
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