有关乙肝的几篇重要内容，望大家都内心的看下。
热休克蛋白gp96的发现为肿瘤和病毒性肝炎等传染性疾病的免疫治疗开辟了新的途径。用免疫组织化学方法对gp96在原发性肝癌组织中的表达进行检测，探讨gp96在抗肝癌免疫反应中的作用。一、资料与方法
1. 组织标本：选取1994～2001年在北京市佑安医院因各种病因死亡，生前血清学乙型肝炎标志物阳性，经尸检诊断为原发性肝癌的病例30例，其中分化型11例，低分化型11例，未分化型8例。同时取16例非肝炎患者在胃切除手术中所取周围肝组织作为对照组。所有病例肝组织标本经甲醛溶液固定，石蜡包埋，5μm厚连续切片备检，苏木素-伊红（HE）染色，观察肝组织的基本病理改变并进行病理诊断。
2. 主要试剂：大鼠抗人gp96单克隆抗体（1:400）为美国NeuMark公司产品。生物素化兔抗大鼠抗体购自北京中山生物技术有限公司。链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶免疫组织化学染色超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。
3. 观察内容及方法：常规标本制作，免疫组织化学DAB染色，光镜下观察gp96在肝组织中的表达情况。用15倍目镜，20倍物镜，数500～1000个肝细胞，计算表达gp96的肝细胞比例。淋巴细胞中gp96的表达：（－）无阳性细胞，（＋）可见阳性细胞。
4. 统计学方法：采用SPSS10.0统计软件，对gp96在肝细胞和淋巴细胞中检出率情况用χ2检验。
二、结果
gp96在肝细胞和癌细胞中的表达形式可分为两种：一种为浆型（图1），这种表达形式是最常见的，几乎见于所有gp96阳性肝组织中；另一种表达形式为核型（图2），仅见于２例肝癌组织。在肝癌组织中gp96阳性细胞常呈团状或结节状分布，提示阳性细胞多来源于１个祖细胞，为１个阳性克隆；同时也可见阳性癌细胞在癌结节中呈弥散性分布。
gp96在对照组正常肝组织和原发性肝癌中检出率分别为12.50%（2/16）及100%(30/30)，平均阳性细胞率分别为0.53%及51.45％，统计学检验显示正常肝组织和原发性肝癌之间检出率和阳性细胞率差异均有显著性（χ2＝33.715，P<0.01）。在原发性肝癌分化型、低分化型及未分化型３组中，gp96阳性细胞平均率分别为47.60%、49.15%和59.92%，统计显示差异无显著性。gp96在淋巴细胞中只有浆型一种表达形式（图3），在对照组肝组织及原发性肝癌中检出率分别为 0（0/16）及93.33%(28/30)，两组间差异有显著性（χ2＝38.163，P<0.01）。
三、讨论
正常肝组织gp96的检出率较低，仅12.50%，且gp96阳性细胞数量少，表达强度弱，平均阳性细胞率仅为0.53%，提示在正常肝组织里gp96呈低表达或弱表达。在原发性肝癌病例组中，gp96的检出率达到100%，平均阳性细胞率为51.45%，明显高于正常对照组及周围正常肝组织。在癌细胞结节中，gp96的表达量及表达强度明显高于癌周正常肝组织和对照组的肝组织。这与gp96是一种与肿瘤抗原提呈有关的分子伴侣，表达量随肿瘤免疫源性的增强而增强的观点相一致[1]。在正常细胞中热体克蛋白90（HSP90）是受细胞周期调控的，但在肿瘤细胞中HSP90的持续高表达是不需要应激的，突变的或不正常的蛋白质存在可直接刺激HSP90的合成[2]。gp96为HSP90家族中的一员，于是我们推测gp96在肝癌细胞中的高表达也是由突变的或不正常的蛋白质刺激引起的。根据恶性程度不同将肝癌组织分为分化型、低分化型和未分化型３组，gp96在癌细胞中平均阳性细胞率分别为47.60%、49.15%和59.92%，统计显示组间差别无显著性，提示虽然gp96在肝癌细胞中的表达明显高于其他非癌组，但它与癌细胞的恶性程度无明显相关性。
在肝组织浸润的淋巴细胞中，gp96在正常肝组织及原发性肝癌中淋巴细胞的检出率分别为0及93.33%。以前的研究证实gp96-抗原肽复合物可在肿瘤细胞表面表达[3]，或在细胞坏死后gp96-抗原肽复合物被释放至细胞外[4]。结果提示gp96在肝癌组淋巴细胞中的高表达率与肝癌细胞的恶性免疫源性有关。推测gp96在原发性肝癌组织中的高检出率可能原因是恶性肿瘤细胞的坏死率显著高于正常细胞，坏死的恶性肝细胞将gp96-抗原肽释放至胞外，随后抗原呈递细胞、B细胞、巨噬细胞等内吞gp96-抗原肽，导致gp96在肝癌组织淋巴细胞中表达率升高。
gp96在癌组织中的表达明显高于正常组织，提示gp96在原发性肝癌患者机体的免疫应答反应中起着重要的作用，为gp96-抗原肽治疗原发性肝癌提供了坚实的理论基础。
核因子κB和环氧化酶-2在酒精性肝病大鼠模型中的表达
核因子κB（NF-κB）是参与细胞凋亡与增殖调控的重要转录因子，环氧化酶-2（COX-2）是其靶基因之一。COX-2参与肝脏疾病的物质代谢紊乱及炎症纤维化过程。现旨在观察NF-κB与COX-2在酒精性肝病（ALD）中的表达，探索其在ALD发病过程中的作用。一、材料与方法
1. 动物模型：SD大鼠24只购自浙江大学医学院动物中心，体重180～210g，经1周喂养适应期后，按照性别相同、体重相近的原则，随机分为两组。实验组以6.72g/kg酒精１次/d灌胃，正常组用等渗盐水灌胃。两组大鼠实验期间均予饮用水及全价营养颗粒饲料喂养。在实验第24周末采用股动脉放血法处死两组大鼠，取肝脏标本，于甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片。
2. 肝组织病理学检查：HE染色观察肝脏基本病理学改变。
3. 免疫组织化学检测NF-κB和COX-2：NF-κB p65小鼠单克隆抗体购自美国Santa Crus公司，稀释比为1:100；COX-2兔多克隆抗体购自美国Cayman Chemical公司。肝组织石蜡切片常规脱蜡水化，经高压锅热修复，0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗，阴性对照以Tris缓冲盐液代替一抗，37℃ 1h，滴加相应的二抗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。细胞浆核均阳性表明NF-κB活化，NF-κB无表达或仅胞浆表达记0，浆核均有表达记1；COX-2阳性定位在细胞浆与核膜，无COX-2表达记0，有COX-2表达记1。
4. 统计学处理：用SPSS10.0统计软件，行Fisher精确概率检验和等级相关性分析。
二、结果
1. 肝脏组织基本病理学改变：实验组有4只大鼠死亡，活组织检查证实胃扩张，胃黏膜广泛糜烂。实验组大鼠肝脏HE染色病理学改变以空泡变性为主，伴不同程度的坏死、炎细胞浸润和脂肪变性。
2. 肝组织中NF-κB的表达：在正常组中，50%大鼠肝脏无NF-κB的表达，50%大鼠在少量肝小叶中央静脉周围肝细胞胞浆可见NF-κB的表达，但细胞核无NF-κB的表达。实验组62.5%大鼠可见肝细胞浆核均有NF-κB的表达，尤其以肝小叶中央静脉周围和汇管区较为明显；25%大鼠可见肝小叶中央静脉周围肝细胞胞浆内有NF-κB的表达，但细胞核无NF-κB的表达；NF-κB的活化增加（P＝0.013），差异有显著性。
3. 肝组织中COX-2的表达：正常组大鼠肝脏无COX-2的表达。实验组75%大鼠的肝组织内有COX-2的表达，COX-2阳性颗粒弥漫于细胞浆，多见于肝小叶中央静脉周围的肝细胞和汇管区增生肥大的库普弗细胞；COX-2的表达明显增加（P＝0.003），差异有非常显著性。
4. COX-2表达与NF-κB活化的相关性分析：酒精组大鼠肝组织NF-κB的活化与COX-2的表达均集中在肝小叶中央静脉周围和汇管区，NF-κB的活化与COX-2的表达具有明显的相关性（r＝0.745，P＝0.034）。
三、讨论
结果显示，长期酒精摄入可以使肝组织中NF-κB活化。NF-κB在ALD的发病机制中的作用复杂，可同时参与氧应激、炎症反应与纤维化过程，以及促进肝细胞再生和抗凋亡等多种病理生理过程。Kono等[1]发现阻断酒精引起的肝组织氧应激，抑制NF-κB的活性，可预防酒精所致的肝损伤。NF-κB的活性受到抑制后，即使存在氧应激，也可阻止酒精诱导的早期肝损伤[2]。Nanji等[3]发现，棕榈油可抑制NF-κB的活化和COX-2的表达，即使在继续饮用酒精的情况下，也可以有效逆转酒精所致的肝组织炎症、坏死和纤维化。ALD中NF-κB的跨核膜转运机制及其影响因素尚待进一步明确，如在本实验中看到，酒精组中有大鼠虽然胞浆内有大量NF-κB的表达，但没有形成核转位。正常大鼠肝组织中无COX-2的表达，但实验组大鼠肝脏COX-2的表达明显增加，并且与NF-κB的活化密切相关，两者都集中在肝小叶中央静脉周围和汇管区。ALD中肝细胞增殖增加，可能与COX-2的表达上调有关。COX-2是启动炎症反应的关键酶，在ALD中COX-2的表达水平与肝脏的炎症呈明显的正相关[4]，也有报道认为COX-2具有抗炎作用，COX-2的表达增加可能对肝损伤具有保护作用[5]。在门静脉周围，COX-2在肝细胞表达为主；在汇管区，COX-2在库普弗细胞表达为主。COX-2在肝组织内不同部位不同类型细胞中的表达，可能起到不同的作用；在疾病的不同阶段，在体内或体外的不同实验条件下，由于刺激因素与细胞类型的不同，COX-2也可能起到不同的作用（损伤或保护）。在ALD中，COX-2表达增加究竟是肝损伤的原因还是结果，有待进一步研究。
肝癌中乙型肝炎病毒整合位点的分离鉴定
乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染是导致肝癌发生的重要原因。HBV整合是致癌的可能机制之一。传统上，HBV整合位点的鉴定主要通过反复的筛选肝细胞癌（HCC）基因文库获得。现报道一种快速分离鉴定HBV整合位点的新方法，为探讨肝癌发生的分子机制提供新的研究手段。1. 资料与方法：（1）资料：7例肝癌组织为上海地区肝癌患者手术标本，患者血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA检测均为阳性。（2）组织DNA抽提：以蛋白酶K/苯酚抽提法自肝癌组织中提取基因组DNA。（3）HBV-Alu-PCR：用于第一轮扩增的PCR引物分别为HBV X基因上游保守序列HB1（nt 1177～1195）和人类基因组Alu重复序列A1。HB1：5′-GCCA AGUGUUUGCUGACGC-3′，A1：5′-AGUGCCAAGUG UUUGCUGACGCCAAAGUGCUGGGAUUACAG-3′。在引物HB1和A1合成时，以dUTP代替dTTP。此外，在A1 Alu序列的5′端，引入了一段“标签”序列（下划线部分）。用于第二轮扩增的PCR引物为位于HB1下游的HBV保守序列HB2（nt 1268～1287）和“标签”序列Tag1。HB2：5′-CCATACTGC GGAACTCCTAG-3′；Tag1：5′-AAG TGTTTGCTGA CGCCAAAG-3′。用于第三轮“半巢式”PCR扩增的引物为HBV X基因5′端起始部位的保守序列HB3 (nt1408～1426) 和Tag1。HB3：5′-TGCGCGGGACGTCCTTTGT-3′。HBV-Alu-PCR具体步骤为：①在第一轮PCR扩增中采用以dUTP代替dTTP合成的引物HB1和A1。在50μl的反应体积中，加入5μl 10倍缓冲液，4μl dNTP (10mmol/L), 引物（10μmol/L）各2μl，SuperTaq DNA聚合酶（上海申能博彩生物科技有限公司）2U以及100ng模版DNA。94℃变性3min后，在94℃ 30s、63℃降至58℃ 30s、72℃ 3min的条件下进行10次循环, 再在退火温度保持58℃的条件下进行5次循环。②PCR反应体系中加入尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil DNA glycosylase，UDG，美国Invitrogen公司）1U，37℃作用30min，使DNA中含dUTP的位点断裂。94℃ 10min中止反应。③在PCR反应体系中加入引物HB2和Tag1各2μl（10μmol/L），再补充SuperTaq DNA聚合酶2U后进行第二轮扩增反应，共35次循环，前10次循环中退火温度自65℃降至55℃，后25次循环中退火温度保持55℃。④取1μl反应产物为模版，以引物HB3和Tag1进行第三轮“半巢式”PCR，共35次循环。（4）DNA测序：PCR产物经纯化后进行全自动测序（中国联合基因科技有限公司）。
2. 结果：（1）病毒－细胞接头处DNA片段的扩增：以HBV-Alu-PCR方法对7例肝癌组织进行了病毒整合状况的分析，结果3例标本（1#、2#、6＃）为阳性，其余4例（3#、4#、5＃、7#）为阴性（图1）。每次实验设白细胞DNA为对照，结果均为阴性。（2）HBV整合位点的序列分析：1#标本中HBV整合于染色体9q34.1（RAB9P40基因）中的一段重复序列；在2#标本中，HBV插入人类基因组克隆RP11-334J6（登录号AL358781）中一功能未鉴定基因MGC10526中，该克隆定位于染色体9q34.3；在6#标本中，HBV插入LAMP基因的内含子部分，该基因定位于染色体3q13.2（表1）。
表1 HBV整合位点分析
标本号 HBV-Alu-PCR产物(bp) HBV中断于X基因3′末端上游(bp) HBV中断处序列 HBV侧翼序列 染色体定位 1# 578 21 ...ttggtctgttcacca gcaccatgctgtaat... 9q34.1
2# 1564 197 ...cccaccaggtcttgc tttcccagtgggagt... 9q34.3
6# 1344 25 ...tctgttcaccgcacc tctgggcaggtttgg... 3q13.2
3. 讨论：参照文献[1]并结合我国HBV流行毒株序列特征，建立了一种基于PCR技术的快速分离HBV整合位点的新方法。Alu序列为人类基因组中常见的重复序列，X基因为HBV中发生整合频率最高的亚基因片断，以HBx基因上游序列和Alu序列为引物进行PCR扩增，理论上可获得包括HBx和细胞基因两者在内的DNA片段。但在一般PCR条件下，Alu引物自身即可扩增出无数位于Alu-Alu间的（不含病毒序列的）细胞DNA片断。为避免由此产生的非特异性扩增干扰，本方法采用了特殊的扩增策略。实验结果证实，这一方法能有效地获得染色体上单拷贝的病毒整合位点。在7例乙型肝炎相关性肝癌标本中，有3例为阳性结果。事实上，作为建立方法的第一步，我们仅考虑HBV正向插入一种情况。可以推测，如果根据Alu反义序列设计引物进行扩增，还可获得高出一倍的阳性率。此外，本方法具有很高的特异性。3例HBV-Alu-PCR阳性产物经测序鉴定，均包含了我们所期望的病毒-细胞接头序列，而白细胞DNA中，未见一例有HBV DNA的整合。插入诱变是病毒致癌的一个重要机制。有结果提示肝癌细胞中被HBV“锚定”的基因均为在细胞增殖转化中起重要调控作用的分子[2]。HBV在人端粒酶逆转录酶基因附近的整合[3]，为研究肝癌发生机制提供了有价值的线索。从结果分析，在HBV插入位点附近也存在着与细胞生长发育密切相关的基因。由于HBV插入序列中的增强子对细胞表达的调控作用并不受方向和位置的限定，因此，上述基因的表达水平在HBV整合后可能也会受到一定程度的影响。
人参皂甙Rh2对人肝癌细胞SMMC-7721信号传导的影响
人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、增强免疫力等多种生物学活性。人参皂甙是人参中主要的活性有效成分。我们曾发现人参总皂甙在体外能诱导人肝癌细胞株HepG2分化[1，2]，最近又发现人参皂甙单体Rh2（G-Rh2）对人肝癌细胞株SMMC-7721有诱导分化作用。G-Rh2诱导SMMC-7721细胞分化过程中，癌细胞的信号传导系统必然会发生改变。通过研究G-Rh2对糖皮质激素受体 (GR)、受体型酪氨酸激酶-胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGFⅠR），Ca2+及蛋白激酶C (PKC)的影响，并观察糖皮质激素拮抗剂-RU486对细胞生长、PKC、 IGFⅠR及细胞周期调节因子的影响，试图从信号传导方面初步探讨人参皂甙Rh2诱导分化作用机制。一、材料与方法
1. 材料：SMMC-7721人肝癌细胞株引自重庆大学生物工程系；G-Rh2由白求恩医科大学有机化学教研室提供，纯度>95%；小鼠抗人cyclin D1、小鼠抗人p16单克隆抗体，兔抗人cyclin E、兔抗人PKCα、兔抗人IGFⅠRβ多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；FITC标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗兔IgG购自北京中山生物技术有限公司；Fura-2/AM、四甲基偶氮唑盐（MTT）、RU486为美国Sigma公司产品；RNA提取试剂为德国Boehringen Mannheim公司产品；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
2. SMMC-7721细胞内游离Ca2+的测定：20μg/ml G-Rh2作用细胞0、1、3、5、24h后分别离心收集细胞，荧光剂Fura-2/AM负载细胞，用荧光分光光度计在选定的激发和发射波长下，测定各组细胞悬液的荧光强度值，计算细胞内游离Ca2+。
3. 检测SMMC-7721细胞PKCα和IGFⅠRβ蛋白表达：20μg/mlG-Rh2处理细胞0、24、48、72h后，用流式细胞仪检测膜型PKCα、胞浆型PKCα和IGFⅠRβ蛋白的表达。参照Yano等[3]检测细胞内蛋白质的方法。
4. 检测SMMC-7721细胞GR mRNA表达：20μg/ml G-Rh2处理细胞0、12、24、72h后，参照TripureTM提取试剂说明书提取各组细胞总RNA，用RT-PCR法检测各组细胞GR mRNA表达水平。GR引物序列为：5′-ATGAGACCAG ATGTAAGCTC-3′（正义）；5′-AATGCCATAAGAAACAT CCA-3′（反义）。β-actin引物序列为：5′-ACACTGTGCCC ATCTACGAGG-3′（正义）；5′-AGGGGCCGGACTCGTC ATACT-3′（反义）。 PCR扩增条件：94℃ 5min；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min。
5. RU486对人参皂甙Rh2诱导SMMC-7721肝癌细胞分化的影响：分别用20μg/ml G-Rh2，5μg/ml RU486和5μg/ml RU486+20μg/ml G-Rh2处理细胞2d、4d和6d后，MTT检测RU486对肝癌细胞增殖的影响，设有对照组和空白试剂组；20μg/ml G-Rh2和5μg/ml RU486+ 20μg/ml G-Rh2处理细胞72h后，流式细胞仪检测RU486对肝癌细胞周期调节因子、PKCα和IGFⅠRβ蛋白表达的影响。
6. 统计学处理：两样本率比较用u检验；两均数比较用t检验。
二、结果
1. G-Rh2对细胞内Ca2+的影响：SMMC-7721细胞经20μg/ml G-Rh2作用1h，细胞内Ca2+下降，随后升高，但始终低于对照细胞Ca2+，处理0、1、3、5、24h时，Ca2+ i分别为890.26×10-6、141.75×10-6、338.49×10-6、351.69×10-6和342.68×10-6 nmol/L。说明G-Rh2能降低细胞内Ca2+，并在1h达到峰谷值。
2. G-Rh2对细胞PKCα和IGFⅠRβ蛋白表达的影响： 20μg/ml G-Rh2作用于SMMC-7721细胞24h后，胞浆型PKCα（P<0.01）和IGFⅠRβ蛋白表达量显著降低，并且随作用时间延长变化更加明显；膜型PKCα蛋白表达量很低，20μg/ml G-Rh2作用后无显著性变化（P>0.05）；见表1。表明G-Rh2能抑制SMMC-7721细胞胞浆型PKCα与IGFⅠRβ蛋白表达，对膜型PKCα蛋白表达无影响。
3. G-Rh2对SMMC-7721细胞GR mRNA表达水平的影响：如图1所示，电泳图谱显示两条泳带，一条为内参照基因β-actin的扩增产物，片段长度为621bp（第2、4、6、8泳道）；另一条为目的基因GR的扩增产物，片段长度为588bp（第1、3、5、7泳道）。可见对照细胞表达GR mRNA较少，细胞经20μg/ml G-Rh2处理12h后，细胞内GR mRNA表达量有所增加，并且随作用时间延长，G-Rh2促进GR mRNA表达的作用更加明显。结果表明G-Rh2能诱导细胞内GR mRNA表达。
4. RU486对G-Rh2诱导分化作用的影响: (1)RU486对SMMC-7721细胞增殖的影响见表2；5μg/ml RU486和空白试剂对SMMC-7721细胞增殖无影响，20μg/ml G-Rh2可以明显抑制细胞生长；但5μg/ml RU486和20μg/ml G-Rh2联合作用时，细胞生长并未受到抑制。提示RU486能拮抗G-Rh2对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。（2）RU486对SMMC-7721细胞周期调节因子、PKCα和IGFⅠRβ的影响：细胞周期调节因子蛋白表达量用荧光强度指数（FI）表示。20μg/ml G-Rh2能诱导周期负调节因子p16蛋白表达，抑制周期正调节因子cyclin D1和cyclin E、胞浆型PKCα和IGFⅠRβ蛋白表达，对膜型PKCα无明显影响；但5μg/ml RU486和20μg/ml G-Rh2联合作用时，细胞没有出现G-Rh2诱导的上述蛋白变化（表3）。提示RU486可以阻断G-Rh2发挥诱导分化作用。
表2 RU486对SMMC-7721细胞增殖的影响（x-±s, n＝4）
分组 处理时间 (d)
2 t值 4 t值 6 t值
RU486 0.5448±0.0021# 1.19 1.4805±0.0618# 1.23 2.4093±0.0523# 0.20
G-Rh2 0.2670±0.0206* 25.73 0.7615±0.0586* 25.84 1.2815±0.0727* 17.04
RU486+G-Rh2 0.5443±0.0123# 0.45 1.4870±0.0522# 1.58 2.3575±0.0965# 0.27
试剂组 0.5275±0.0158# 1.65 1.4940±0.0449# 1.52 2.4050±0.0608# 0.12
对照组 0.5413±0.0055 1.5290±0.0098 2.3975±0.1090
A。=0.1218为G-Rh2和RU486处理细胞前的吸光度值；与对照组比较，# P>0.05，* P<0.01
表3 RU486 对SMMC-7721细胞周期调节因子、 PKCα、IGFⅠRβ蛋白表达的影响
分组 cyclin D1(FI) cyclin E(FI) p16(FI) IGFⅠRβ(FI) 胞浆型PKCα(%) 胞膜型PKCα(%)
对照 2.39 1.11 1.92 2.94 99.35 6.33
G-Rh2 0.92 0.35 2.78 0.62 64.76* 2.20
RU486+G-Rh2 2.16 0.95 1.91 2.58 97.86# 4.51
G-Rh2：人参皂甙单体Rh2；PKC：蛋白激酶C；IGFⅠR：胰岛素样生长因子Ⅰ受体；* 与对照组比较，u＝6.37，P<0.01；# 与G-Rh2处理组比较，u＝5.90，P<0.01
三、讨论
Kim等[4]研究了人参皂甙Rh2和Rh3诱导HL-60细胞向粒系分化过程中PKC异构体的调控作用，发现PKC活性降低。本研究结果提示G-Rh2可能通过降低细胞内Ca2+来抑制PKCα的转位和激活，并通过抑制细胞内PKCα蛋白表达，最终阻碍PKCα介导的增殖信号传导过程。对于许多恶性肿瘤细胞而言，外源性和自分泌性IGFs是很强的丝裂原，IGFs及IGFⅠR介导的信号传导不仅可以促使恶性肿瘤细胞的增殖，同时还在细胞的转化、肿瘤发生发展过程中起关键作用[5]。本结果提示肝癌细胞有高表达的IGFⅠR；G-Rh2可能通过降低肝癌细胞IGFⅠR表达来阻断IGFs-IGFⅠR增殖信号传导通路而抑制肝癌细胞增殖和诱导其分化。由于G-Rh2在分子结构上和糖皮质激素（GH）非常相似，所以推测G-Rh2是通过结合细胞核内GR发挥诱导分化作用的。RU486是GH拮抗剂，与GR有较GH更强的亲和性。本研究结果提示G-Rh2作为细胞外一种亲脂性信号分子，进入胞内后与胞核中的GR核受体结合，可能通过抑制肝癌细胞PKCα和IGFⅠRβ表达来阻碍PKCα和IGFs-IGFⅠR介导的增殖信号传导通路，从而抑制细胞的生长和诱导其分化。G-Rh2可能是通过和GR结合而发挥诱导肝癌细胞分化作用的，在此过程中G-Rh2阻断Ca2+-PKCα和IGFⅠRβ介导的增殖信号传导通路可能起了重要作用。
DNA芯片技术检测乙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的初步研究
现分别针对乙型肝炎病毒（HBV）、丁型肝炎病毒（HDV）基因保守区域设计多对聚合酶链反应（PCR）引物，打印制备成芯片，并用限制性显示（RD）技术标记样品，探索此方法制备基因芯片的可行性。一、材料与方法
1. 材料：pMD18-T Vector、PCR试剂、dNTP、EcoRⅠ、Sau3AⅠ购自大连宝生物公司；受体菌XL-1由广州总医院肿瘤分子生物学研究所保存；有Cy5标记通用引物U及Cy5-dCTP购自美国Gibco公司；Pixsys5500芯片打印仪购自美国Cartesian公司，ScanArray Lite芯片扫描仪及分析软件Quantarray购自美国Gsi Lumonics公司；探针模板：HBV质粒由广州军区广州总医院肿瘤分子生物学研究所构建保存；HDV质粒pDL553由美国费城癌症研究中心S.Gudima博士馈赠。
2. 方法：（1）制备探针：针对HBV、HDV保守区域分别设计10对、4对引物。PCR扩增HBV 94℃ 5min；94℃ 55s;55℃ 55s，72℃ 55s；30个循环；72℃ 5min。HDV 94℃ 5min;94℃ 45s，50℃ 45s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 5min。纯化PCR产物按照纯化试剂盒说明书操作。部分纯化后PCR产物放-20℃留做探针待用。（2）分子克隆：将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接，16℃ 2h。转化XL-1细菌，平板克隆。用pMD18-T载体引物进行PCR后初步鉴定，测序。用ABI PRISMTM377自动测序仪对克隆进行序列分析， 经BLAST检索与GenBank数据库进行同源性比较分析。（3）打印芯片：将纯化后PCR产物加DMSO调整浓度为500ng/μl。以水稻基因、K562细胞、大肠杆菌为阴性对照，50% DMSO为空白对照，用Pixsys5500芯片打印仪在Corning玻片上打印阵列为12×12的点阵(图1)。（4）RD技术标记样品[1，2]：用Sau3AⅠ酶切后连接上接头，之后作为PCR模板，用Cy5标记的通用引物U（5′-GTTTGGCTGGTGTGGATC-3′）扩增，50μl体系，95℃ 2min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃，5min。（5）杂交：在暗室条件下，标记后的样品95℃变性后加到经预杂交的芯片阵列表面，轻轻覆上盖玻片，放入杂交盒内，42℃杂交10h。杂交完毕，60℃ 0.1%×SSC洗涤10min，双蒸水冲洗干净，避光晾干。（6）检测分析：用美国Gsi Lumonics公司的ScanArray Lite芯片扫描仪扫描芯片，并通过分析软件Quantarray分析荧光强度和比值。
二、结果
1. PCR产物反应结果：PCR扩增HBV、HDV分别得到10、4个片段，在15g/L琼脂糖凝胶电泳，可得清晰的电泳图，片段大小与理论预期一致。
2. 序列分析：将阳性克隆用ABI PRISMTM310自动测序仪进行序列分析，与GenBank数据库进行两序列Blast同源比较，均与理论符合。
3.基因芯片杂交信号扫描结果：HBV、HDV、HBV和HDV混和物均有明显杂交信号，阳性内参也有明显杂交信号，空白和阴性对照均无杂交信号检出（图2）。
三、讨论
目前，HBV、HDV诊断方法主要仍用酶联免疫吸附法，由于血清学交叉反应的广泛存在，使血清学诊断受到严重干扰；另外由于“窗口期”，人体对病毒感染免疫应答有一定迟滞，对无免疫应答或免疫力低下者的检测更存在困难。近年来发展的各种核酸杂交法和PCR、RT-PCR法各具优点，但也有敏感性低、易交叉污染等缺点。基因芯片技术是一种高通量的基因检测与分析方法，通过芯片上集成的大量探针对样品进行平行检测：不仅可通过应用许多不同的特异性探针来检测同一靶分子，大大降低假阳性率，显著提高信噪比[3]；而且可通过集成多种肝炎病毒的基因探针来对病原体进行快速诊断、鉴别诊断与基因分型[4, 5]。
目前我们所用的基因诊断芯片，采用点样法用Cartesian芯片打印仪将HBV、HDV多个保守基因片断分子克隆后，直接用芯片点样仪点到特制的玻片上，并同时点上用于系统监控的内参照基因，其系统监控由3个主要部分组成：（1）空白点，是不含任何基因的DMSO点样液。（2）阴性内参照，是与HBV、HDV没有同源性的基因片断，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标。（3）阳性内参照，在荧光标记时，加入检测体系中并作为HBV、HDV的阳性内参照。制作的芯片特点是定量准确，重现性好，制作芯片的成本低，操作简便。
样品的标记方法是基因芯片技术的一个重要环节，标记效率的高低直接关系到杂交结果的质量。我们对样品标记采用了RD技术[6, 7]，该法的标记效率较高，且不受样品序列的影响。传统的逆转录法标记，只能用于RNA样品的标记，不能用于DNA样品，且受样品中核酸序列的影响。随机引物法虽可用于两种样品的标记，但标记效率低，荧光强度弱。RD技术不仅可用于RNA样品的标记，还可用于DNA样品的标记，且标记效率高（荧光结合效率可高达100%），荧光强度强；通过限制性内切酶的酶切，样品中的病原体基因被切成一定大小的片段（250bp左右），然后再经过荧光标记与芯片上探针杂交，可增加杂交的动力学范围，减小假阳性；标记不同病原体基因只需一种引物，为进一步更多种的肝炎病毒联合检测奠定了基础。目前从杂交结果看来，效果理想。
白细胞介素-10、血小板衍生生长因子-BB对肝星状细胞表达
研究拟通过观察外源性血小板衍生生长因子（PDGF）-BB和白细胞介素-10（IL-10）干预对肝星状细胞（HSC）表达表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）mRNA的变化，进一步探讨PDGF-BB及IL-10在纤维化发生中的作用及其机制。1. 材料与方法：(1)材料：HSC细胞系（细胞系rHSC-99）由翁山耕博士惠赠，重组PDGF-BB及IL-10购自深圳晶美生物工程公司，逆转录酶、Oligo购自德国Promega公司，引物、Taq酶、dNTP购自上海生工生物工程公司，DMEM培养基美国Gibco公司，RNA抽提试剂盒购自美国Gentra公司。(2)HSC的培养与分组：将传代培养的HSC用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成5×104个/ml，接种于24孔培养板，待细胞铺满孔底，换含1%胎牛血清的DMEM，培养24h，吸弃上清液，而后分为4 组，每组5孔，对照组（C组）加1ml含1%胎牛血清的DMEM，PDGF-BB干预组（P组）加20ng PDGF-BB与1ml含1%胎牛血清的DMEM，IL-10干预组（I组）加20ng IL-10与1ml含1%胎牛血清的DMEM，IL-10、PDGF-BB共干预组（T组）加20ng IL-10、20ng PDGF-BB、1ml含1%胎牛血清的DMEM，培养24h。(3)总RNA抽提与测定：按试剂盒说明操作，抽提各孔HSC的总RNA，用紫外分光光度法测定RNA含量及纯度，A260/A280均在1.8～2.0之间。(4)EGF和bFGF mRNA表达的检测：cDNA的合成：取总RNA 2μg, Oligo 0.5μl, 加水至10μl，至70℃ 5min后置冰水冷却；依次加入M-MLV 5×反应缓冲液5μl，dNTP (10mmol/L) 5μl, M-MLV RT(200U/μl) 1μl，水4μl，混匀，置37℃60min,70℃10min。聚合酶链反应（PCR）：体系为50μl，内含cDNA 2μl，10×buffer plus 5μl，dNTP(10mmol/L) 0.5μl，上、下游引物（20μmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl）0.6μl，用水补至50μl。PCR反应在0.2ml薄壁管中进行，用Perkin Elmer2400仪扩增。PCR反应参数：94℃ 5min；94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 60s，32个循环；72℃延伸7min。(5)结果判断：mRNA表达判定：将12μl RT-PCR产物在20g/L琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察电泳结果并照相。用凝胶成像系统测量扩增条带灰度值，以bFGF或EGF与β-actin的比值作为它们的相对表达水平，分析各组间差异。(6)统计学处理：用SPSS10.0统计软件进行方差分析和LSD-t检验。
2. 结果：(1)PDGF-BB、IL-10对HSC表达bFGF的影响：bFGF mRNA水平I组为0.085±0.015，C组为0.115±0.009，t＝4.08，P<0.01。P组为0.184±0.013，明显高于对照组，t＝9.34，P<0.01。T组为0.109±0.008，较P组有所降低，t＝9.56，P<0.01（图1）。表明PDGF-BB可促进bFGF的mRNA表达，而IL-10在转录水平上对HSC表达bFGF有一定的抑制作用，并可抑制PDGF-BB促bFGF表达的作用。(2)PDGF-BB、IL-10对HSC表达EGF的影响：EGF mRNA水平I组为0.390±0.009，C组为0.253±0.018，t＝4.88，P<0.01。P组为0.299±0.014，则明显高于对照组，t＝14.62，P<0.01。T组为0.430±0.015，较P组增高，t＝14.40，P<0.01（图2）。表明PDGF-BB可促进EGF的mRNA表达，IL-10在转录水平上对HSC表达EGF也有一定促进作用。提示IL-10、PDGF-BB对该HSC细胞系EGF的转录有明显促进作用。
3. 讨论：EGF能刺激肝细胞、HSC的分裂、增殖，是维持正常肝小叶结构的关键细胞因子。bFGF是肌成纤维细胞的致丝裂原因子。因此EGF及bFGF在肝损伤的修复与肝细胞再生过程中具有重要意义。PDGF-BB是肝HSC最重要的促有丝分裂原，在肝纤维化早期，受慢性炎症刺激，库普弗细胞产生并释放PDGF-BB，并与HSC上的PDGF-BB受体结合，起到促进HSC的增殖、活化和趋化。IL-10是由TH2细胞产生的一类抑制性免疫调节因子，具有强大的抑制炎症和巨噬细胞功能的作用。在PDGF-BB的刺激下，活化的HSC表达EGF、bFGF的mRNA显著增高。提示PDGF-BB对HSC的增殖、活化和趋化作用可能与EGF、bFGF表达增高有关。而IL-10单独或与PDGF-BB联合作用于活化的HSC，bFGF的mRNA表达较PDGF-BB单独作用组明显降低。提示IL-10的抗纤维化作用可能与之能降低bFGF mRNA水平有关。但IL-10却上调EGF mRNA的表达，可能与EGF上调金属蛋白酶1，促进I型胶原的降解，导致ECM的平衡失调。也可能通过旁分泌作用促进肝细胞再生，抑制肝细胞凋亡起到一定的作用。
缬沙坦对肝星状细胞的增殖及胶原合成的影响
对受体生物学功能及肾素-血管紧张素系统（RAS）的研究发现，RAS的主要介质血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）可诱导纤维化而与其血液动力调节作用无关。研究以肝星状细胞（HSC）系HSC-T6细胞为主要实验对象，探索缬沙坦对AngⅡ引起的HSC-T6细胞的增殖、细胞内钙浓度及胶原合成影响，从而在体外探讨缬沙坦抗肝纤维化的可能机制。一、材料与方法
1. 实验材料及药物：HSC系HSC-T6细胞由美国纽约西奈山医学院肝病中心实验室Friedman教授惠赠。Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）及转化生长因子β1（TGFβ1）测定试剂盒为美国TPI公司产品。AngⅡ购于美国Sigma公司，缬沙坦（商品名代文）原粉由诺华制药有限公司惠赠。
2. 实验方法：(1)四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法：复苏后处于对数生长期中的HSC-T6细胞，均匀种于96孔培养板中。加入200μl浓度为0.5mg/ml的MTT产品后在酶标仪上检测波长为492nm的吸光度值（A）。细胞存活率=（药物组A值/对照组A值）×100%。(2)细胞增殖采用3H-TdR掺入法: 复苏后处于对数生长期中的HSC-T6细胞，均匀种于24孔培养板中,收获细胞前6h每孔加入3H-TdR 2μCi（放射性浓度为1mCi/ml）。用Beckman LS-6500型β液闪记数仪测定标本核素并记数率，用每分钟核素的cpm数代表样品3H-TdR掺入值。(3)HSC-T6细胞内Ca2+测定的方法：HSC-T6细胞培养24h，避光加入Fluo-3/AM 5μl（原浓度为1mmol/L）,在激光共聚焦显微镜下随机扫描30～40个HSC内荧光吸光度值，用荧光吸光度值代表HSC内Ca2+浓度。然后加入缬沙坦或（和）AngⅡ连续测定HSC内荧光吸光度值。(4)HSC-T6细胞Col-Ⅰ及TGFβ1的表达及分泌: 按前述方法分组及加药，培养48h后收获HSC，提取总RNA，并进行cDNA的合成及Col-Ⅰ与TGFβ1扩增产物的半定量分析[1]。用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）法测定培养上清液的Col-Ⅰ及TGFβ1的浓度。
3. 统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行数据的分析处理, 结果以x-±s表示。先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件者行单因素方差分析，不符合上述条件者行秩和检验。
二、实验结果
1. 药物对HSC-T6细胞生长影响：AngⅡ在10-8mol/L～10-5mol/L浓度之间，HSC-T6细胞存活均在90%以上,选择使HSC-T6细胞存活90%以上的10-5mol/L作为以下实验浓度。同样选择缬沙坦10-5mol/L作为以下实验浓度。
2. 缬沙坦对HSC-T6细胞增殖的影响（3H-TdR掺入法）：对照组、AngⅡ组及缬沙坦+AngⅡ组的3H-TdR掺入量分别为（7123.3±1266.6）×cpm、（10419.6±888.9）×cpm、（7027.9±1382.1）×10 cpm值。与对照组比较，AngⅡ可使HSC-T6细胞的3H-TdR掺入量增加，t＝3.690, P＝0.032，缬沙坦可降低HSC-T6细胞的3H-TdR掺入量, t＝3.575, P＝0.028。
3. 缬沙坦对HSC-T6细胞内游离钙浓度的影响：随着AngⅡ浓度的增加, HSC-T6细胞内游离钙浓度增加的幅度增大, 缬沙坦可明显阻断AngⅡ引起的HSC-T6细胞内钙浓度的增加，AngⅡ10-5mol/L组为28.54±26.21，缬沙坦+AngⅡ组为5.65±4.03，F＝5.537, P＝0.0001，差异有极显著性。
4. 缬沙坦对HSC-T6细胞胶原的表达和分泌的影响：(1)缬沙坦对HSC-T6细胞Col-Ⅰ及TGFβ1 mRNA水平的影响: 与对照组比较, AngⅡ可增加Col-Ⅰ及TGFβ1 mRNA的水平，缬沙坦可降低Col-Ⅰ及TGFβ1 mRNA的水平，差别有显著性（表1）。(2)缬沙坦对HSC-T6细胞分泌胶原及TGFβ1的影响：缬沙坦+AngⅡ组HSC-T6细胞培养上清液中Col-Ⅰ及TGFβ1的浓度，分别为8.66±1.46和89.69±6.37，AngⅡ组分别为10.68±0.84和208.47±133.17，F＝2.766，P＝0.024和F＝9.287，P＝0.029，差异有显著性。
表1 缬沙坦对HSC-T6细胞Col-Ⅰ及TGFβ1 mRNA
表达的影响（x-±s）
组别 样本数 Col-Ⅰ/GAPDH TGFβ1/GAPDH
对照组 5 0.802±0.097 0.797±0.063
血管紧张素Ⅱ组 5 0.904±0.094# 0.947±0.046△
血管紧张素Ⅱ组+缬沙坦 5 0.677±0.080* 0.820±0.074**
缬沙坦 5 0.715±0.059 0.860±0.069
Col-Ⅰ：Ⅰ型胶原；TGFβ1：转化生长因子β1；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶；与对照组比较，△ t＝4.314，P<0.01，# t＝2.691，P<0.05；与血管紧张素Ⅱ组比较，* t＝4.106，P<0.01, ** t＝3.233，P<0.05
三、讨论
既往研究表明AngⅡ可促进离体培养血管平滑肌细胞的DNA合成、增殖与肥大[2]。本研究结果表明AngⅡ可以刺激HSC-T6细胞的增殖, 缬沙坦可抑制AngⅡ引起的细胞增殖。AngⅡ也可使HSC-T6细胞内钙浓度增加，缬沙坦可明显降低AngⅡ引起的HSC-T6细胞内钙浓度的增加, 这与文献报道一致[3]。外源性AngⅡ可通过AT1R增加心肌的纤维母细胞与Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的粘附，促进TGFβ1基因及蛋白的表达，这些作用均被AT1R拮抗剂艾博沙坦阻断[4]。结果表明AngⅡ可上调大鼠HSCⅠ型胶原及TGFβ1 mRNA的水平，缬沙坦可降低HSC-T6细胞Col-I及TGFβ1 mRNA的水平及培养上清液中Col-Ⅰ和TGFβ1的浓度，与文献报道一致[5]。说明AngⅡ引起的HSC的增殖及胶原和TGFβ1 mRNA表达和分泌主要通过AT1R介导的。提示AngⅡ可能参与肝纤维化的发展，AngⅡ和AT1R可能在肝纤维化中发挥重要的促进作用。
缬沙坦通过作用于AT1R抑制肝星状细胞的增殖及胶原蛋白的合成，可能是其抗纤维化的机制之一。
树突状细胞与肥大细胞瘤细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应
该研究利用聚乙二醇将相同来源的树突状细胞(DC)与小鼠的肥大细胞瘤系P815融合在一起，形成治疗性DC瘤苗,并对这种树突状细胞瘤苗免疫小鼠后抑制肿瘤生长的作用及其机制进行初步探讨。一、材料与方法
1.材料: 8～10周龄Balb/c 小鼠(H-2Kd)，购自第四军医大学实验动物中心。红细胞裂解液，GNK缓冲液由本室配制。RPMI 1640完全培养基购自美国Gibco公司,HEPES、鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（mrGM-CSF）、重组白细胞介素（mrIL-4）为美国Gibco公司产品，FITC标记的大鼠抗小鼠DEC205（CD205）等单克隆抗体（McAb）购自深圳晶美公司、羊抗大鼠二抗抗体及FITC标记的羊抗大鼠二抗抗体购自美国Pharmingen公司，HRP标记羊抗鼠IgG购自英国Amersham公司。Cyto Tox 96非放射性细胞毒试剂盒购自美国Promega公司。四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂及Con A、Mytomicin C购自上海华美公司。
2. DC及其前体的分离纯化和其体外扩增：无菌制备BALB/C小鼠骨髓；先后用红细胞裂解液、抗鼠CD4、CD8、B细胞McAb和补体溶液，依次去除红细胞，T、B细胞，粒细胞和单核-巨噬细胞等混杂细胞而获得纯化的DC及其前体；又在GM-CSF和IL-4协同诱导下培育，DC前体分化发育成DC。
3. DC细胞的鉴定：将收集到的树突状细胞用如下方法初步鉴定:①扫描电镜观察并摄片。②FACS检测细胞表型：DC经FITC标记的DC特异性抗原DEC205（CD205）免疫染色后上机检测。③同种异型混合淋巴反应（MTT法）。
4. DC-P815细胞的体外融合及体内抗肿瘤实验：取诱导扩增的DC与Balb/C小鼠的纤维肉瘤细胞（P815细胞）按10:1混合，离心5min后弃上清液，边振荡边加入1ml 50% PEG，2min后用1640液稀释离心，再稀释，取悬浮细胞计数，按每只小鼠2.0×106剂量于皮下接种（融合细胞组）。将P815细胞经2000cGy剂量60钴射线照射灭活后，用和融合细胞组相同的比例与DC混合，每只小鼠以2.0×106剂量于皮下接种（混合细胞组）。另将P815细胞经2000cGy剂量60钴射线照射灭活后直接以每只小鼠2.0×106剂量皮下注射（死P815组）。最后一组小鼠用0.1ml等渗盐水皮下注射（NS对照组）。4组小鼠每组皆为10只，注射部位均为左侧背部。4组小鼠接种免疫14d后以同样方法再接种注射1次。10d后用P815细胞分别攻击各组小鼠，每只于右侧背部皮下注射2.0×106/ml P815细胞0.1ml。观察P815肿瘤的生长，每5d记录1次肿瘤大小，为最长径×垂直径长（mm2）。
5. 免疫小鼠脾细胞CTL杀伤功能检测：（1）效应细胞制备：2次免疫后处死Balb/c小鼠，无菌条件下取出脾脏，置铜网上研磨，4ml无血清RPMI 1640培养基冲洗，缓慢加至已预先加了2ml淋巴细胞分离液的试管中，2000r/min离心25min，缓慢、小心吸取含淋巴细胞的白色层液于无血清RPMI 1640培养基中，洗涤2次并计数后转至培养瓶中，培养液含ConA 2.5μg/ml, rhIL-2 50U/ml。（2）刺激细胞制备：将靶细胞P815加入含Mitomycin C 50μg/ml的1640培养基中，置于37℃、体积分数为5% CO2孵箱中培养45min，用无血清1640洗3次。按刺激细胞:效应细胞=1:10的比例混合，共培养3d。（3）CTL活性测定：乳酸脱氢酶法，参照试剂盒说明书进行。效应细胞和靶细胞作用4h，反应终止后，每孔取50μl上清液检测LDH的释放，以490nm波长测定吸光度（A）值，按说明书计算。计算方法：特异性释放=（实验释放-效自发释放-靶自发释放）/（靶最大释放-靶自发释放）×100%。
6. 统计学处理：采用两样本t检验和单因素方差分析。
二、 结果
1. DC的光镜和扫描电镜观察: 每只小鼠分离出骨髓细胞约（3.5～4.0）×107个。经24h培养后，在贴壁细胞表面有许多集落出现，48h后筛选吸弃悬浮的集落细胞，剩小部分半贴壁半悬浮的DC集落存在,到第4天时,此类半贴壁集落数量剧增,集落表面的细胞可见有长短不一的突起。继续培养至6～8d,集落丰富,并开始有大量细胞从集落中释放出来，释放的细胞突起较长。细胞涂片Gimesa染色可见细胞核偏位,突起较多。用扫描电镜检测细胞表面突起，显示了DC的基本形态。
2. DC的体外诱导扩增和表面标志鉴定：用小鼠特异性单克隆抗体DEC205进行荧光染色，可见诱导的细胞膜表面有荧光着色，染色均匀。FITC标记的DC特异性抗原DEC205免疫染色后上机检测，DC和DC-P815阳性率分别为71%和30%。
3. DC/P815融合细胞免疫小鼠后用肿瘤细胞攻击的结果观察: 融合细胞组小鼠背部用P815细胞攻击后第15天和第20天，分别有2只背部长出可见肿瘤（40%），混合细胞组小鼠第10天有4只，第15天有2只背部长出肿瘤（60%）。死亡Sp/0细胞组小鼠第10天有5只，第15天有3只背部长出肿瘤（80%）。对照组小鼠第10天全部长出肿瘤（100%），第35天已死亡3只。至第35天终止实验，各组小鼠背部瘤体平均体积分别为：融合细胞组（15.7±1.4）mm2，混合细胞组（44.3±2.7）mm2，死细胞组（47.0±3.1）mm2，对照组（96.0±5.7）mm2。融合细胞组与混合细胞组、死细胞组及对照组比较，差异均非常显著(P<0.001)。4组小鼠瘤体重量分别为融合细胞组1.2g，混合细胞组4.5g，死细胞组4.9g，对照组8.7g。融合细胞组与其他组比较差异有显著性(P<0.05)。
4. 小鼠脾细胞的特异性CTL功能测定结果：融合细胞组脾细胞的特异性CTL杀伤活性强于混合细胞组和死细胞组(P<0.05)，且杀伤活性与效应细胞数量成正比。
三、讨论
近年来的研究证明用各种肿瘤抗原体外刺激DC，然后回输或免疫接种荷瘤宿主，可以诱导机体产生明显的抗肿瘤效应。本实验结果显示小鼠骨髓DC在体外诱导扩增，与小鼠P815肿瘤细胞融合后，作为疫苗免疫同基因小鼠，可显著抑制这些小鼠肿瘤的生长，其拮抗P815细胞攻击的能力不仅显著强于用等渗盐水的对照组小鼠，也明显强于用灭活P815细胞与DC混合组和仅用灭活P815细胞免疫的小鼠。
DC作为专职抗原递呈细胞，具有强大的抗原提呈功能及免疫佐剂作用，能诱导出高效而特异性的抗肿瘤免疫。我们的实验亦证明，用DC肿瘤细胞融合的杂交瘤免疫小鼠后，产生的抗肿瘤效应主要是特异性CTL的作用，融合细胞组小鼠脾细胞在体外显示出强于其他各组小鼠的CTL杀伤活性。因而DC与肿瘤细胞融合的杂交瘤作为肿瘤疫苗用于人类肿瘤的治疗具有很大的应用潜力，将可能成为一种有希望的肿瘤生物治疗方法。
三磷酸腺苷生物发光法检测肝癌组织细胞对化疗药物敏感性的研究
采用三磷酸腺苷（ATP）生物发光法检测26例肝癌患者肝癌组织细胞对化疗药物的敏感性，现报道如下。一、资料与方法
1. 研究对象：（1）病例资料：收集2001年9月～2003年5月在中山市人民医院手术的肝癌患者肝癌组织标本，共26例，均为原发性肝癌。病理诊断：肝细胞癌25例、肝细胞胆管细胞混合癌1例。其中男21例，女5例，平均48.9岁，术前无化疗。（2）试剂：RPMI 1640培养基和胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。ATP-肿瘤化疗药敏（TCA）试剂盒为德国DCS公司产品，包括：完全分析培养基、肿瘤组织解离酶、ATP抑制剂、ATP提取液、荧光素-荧光素酶检测试剂等。（3）化疗药物：丝裂霉素（MMC）、表阿霉素（EPI）、10-羟基喜树碱（HCPT）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂（DDP）、紫杉醇（PAC）、吡柔比星（THP）。
2. 方法：(1)标本预处理：肝癌术中标本保存在RPMI 1640培养液中立即送实验室。按照说明书操作，剔除非肿瘤组织，将肿瘤组织剪成约1mm3碎块，置组织解离酶中，37℃孵育2～4h。待组织消化成细胞悬液后，4℃ 1000r/min离心6min后弃上清液，用RPMI 1640液清洗2次，制成单细胞悬液。台盼蓝染色计活细胞数，每次试验需活细胞总数约2×106个，悬液中肿瘤细胞数>60%。(2)ATP-TCA试验：试验药物浓度(TDC)根据化疗药物血浆峰值和临床应用评估资料确定。根据每种药物TDC值，将上述药物、完全分析培养基和细胞悬液加至96孔培养板，梯度稀释TDC成6种浓度：200.0%、100.0%、50.0%、25.0%、12.5%和6.3%，设无药对照和ATP最大抑制对照。37℃，5% CO2培养6～7d。提取ATP，加入荧光素-荧光素酶，混匀后上MLP自发光检测仪（德国Berthold公司）检测。(3)结果判定标准：检测数据自动转入数据分析软件，得到化疗药物的剂量-抑制曲线、药物抑制曲线面积值（AUC）、IC90 TDC、IC50 TDC。高度敏感药物：IC50<25% TDC、IC90<100% TDC；部分敏感药物：IC50<25% TDC、IC90>100% TDC；低度敏感药物：IC50>25% TDC、IC90<100% TDC；耐药：IC50>25% TDC、IC90>100% TDC。(4)统计分析：用SPSS10.0软件行t检验、相关性分析。
二、结果
1. ATP-TCA检测26例肝癌患者肝癌组织，无一例污染，其中1例肝癌细胞株带药均培养成功。5例肝癌组织培养6d后无药对照组平均ATP荧光值较小（400～600），其余病例平均1500以上。
2. 26例肝癌患者癌组织ATP-TCA结果见表1。
3.1例肝癌癌细胞株BEL-7402化疗药物带药培养6d，结果显示：对PAC、HCPT高度敏感，对5-FU低度敏感，对MMC、EPI和DDP均为耐药。BEL-7402细胞药物剂量-抑制曲线得出AUC值从高到低依次为PAC>HCPT>5-FU>EPI>DDP>MMC。PAC的IC50和IC90的药物浓度分别为：3.51% TDC(0.48mg/L)、12.88% TDC(1.75mg/L)，5-FU的IC50和IC90的药物浓度分别为：34.66% TDC(7.79mg/L)、73.45% TDC(16.52mg/L)。两两药物相关性检验显示，PAC与HCPT、MMC、5-FU的相关系数稍高，但只与HCPT显著相关（r＝0.519，P<0.01）。
表1 26例肝癌组织三磷酸腺苷-肿瘤化疗药敏实验结果（x-±s, μg/ml）
组别 药物抑制曲线面积 敏感度分级 (例)
高度敏感 部分敏感 低度敏感 耐受 敏感率(%)
5-FU 10433.97±3662.27 0 3 0 23 11.5
DDP 11486.81±3339.38 0 2 1 23 11.5
EPI 10382.39±3015.04 0 0 3 9 25.0
MMC 14 457.66±3015.04 7 2 4 11 54.2
THP 14557.35±3079.66 2 1 8 3 78.6
HCPT 16328.71±3628.69 16 2 1 5 79.2
PAC 16930.12±1305.64 12 1 10 3 88.5
5-FU：5-氟尿嘧啶；DDP：顺铂；EPI：表阿霉素；MMC：丝裂霉素；THP：吡柔比星；HCPT：10-羟基喜树碱；PAC：紫杉醇。药物抑制曲线面积比较：HCPT高于MMC和5-FU（t＝2.02、P<0.05，t＝5.78，P<0.01）；THP高于EPI（t＝3.01，P<0.01）
三、讨论
ATP-TCA试验结果表明，肝癌组织存在较为明显的个体差异性，有的肿瘤仅对6种药物中的一种或两种低度敏感，有的则对3种药物高度敏感。26例肝癌组织药敏数据显示PAC、HCPT、THP和MMC的单药效果相对较好，临床上常用于消化道肿瘤化疗的5-FU效果较差。对PAC应用于肝癌细胞株BEL-7402后诱导凋亡抑制细胞增殖的研究发现，短期处理可引起肝癌细胞的大量坏死，但凋亡率相对较低（另文发表），因此认为PAC用于肝癌化疗还需谨慎。本组肝癌细胞对HCPT敏感率达79.2%，且24例中16例高度敏感，细胞株对HCPT也高度敏感，提示HCPT优于目前临床常用的MMC和5-FU，可作为治疗肝癌的首选药物之一。本组前14例肝癌患者肝细胞采用THP，药物敏感率为78.6%，后12例应临床要求改成EPI，敏感率仅为25.0%，无高度或部分敏感，只有3例低度敏感，说明THP优于EPI。ATP-TCA试验的优点：使用完全分析培养基，随培养时间延长，肿瘤细胞的比例大大提高；一次实验可以得到剂量-抑制曲线，而不是单点浓度，更有利于临床医生选择敏感药物；结果重复性较好。在实验中需注意肝癌细胞的活性，标本离体后送实验室时间越短，活细胞越多，超过1h活细胞数明显下降，培养6～7d后无药对照孔的荧光值较低。 :99ganbb: :99ganbb:
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