育龄妇女慎用抗HBV药物
[align=center][size=5][color=black][b]育龄妇女慎用抗HBV药物[/b][/color][/size][/align][align=right][size=2][color=black]中南大学湘雅医院感染科 [font=楷体_GB2312]范学工[/font][/color][/size][/align][font=楷体_GB2312][size=2][/size][/font]医生在对乙型肝炎病毒(HBV)感染的育龄妇女进行抗病毒治疗时,常会考虑患者是否已妊娠或近期有无生育计划,因为抗病毒药物种类多样,而多种药物具有生殖毒性和发育毒性,这是不得不考虑的危险因素。
HBV感染的育龄妇女接受抗HBV治疗具有特殊性,在医生决定对其进行抗病毒治疗之前,首先应该明确,这类患者接受抗病毒治疗可有2个获益,即不仅可治疗其乙型肝炎,而且对阻断HBV母婴传播可能有一定作用。其次,医生应根据患者的生育情况指导用药。
现特邀中南大学附属湘雅医院感染科的范学工教授撰文,综述目前常用的抗HBV药物的生殖毒性及发育毒性,并总结HBV感染的育龄妇女接受抗病毒治疗的策略。
抗HBV药物的生殖毒性与发育毒性
[b]干扰素α
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在动物实验中,干扰素α具有明显的生殖毒性。研究人员给雌猴注射干扰素α之后,雌猴出现月经周期延长,伴随17β-雌二醇和黄体激素峰值的减低和延迟,停药后,月经恢复正常。研究人员还给予妊娠恒河猴应用干扰素α,虽然在其后代中未发现致畸现象,但其流产率显著升高。
目前,尚无干扰素α用于妊娠妇女的资料,但其对人类致畸的可能性不能排除。因此,准备生育及已妊娠的妇女均[color=red]禁止[/color]使用该药。
[b]拉米夫定(♀=B)
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在动物实验中,研究者予大鼠经口服用拉米夫定4000 mg/(kg·d),其血药浓度为人临床推荐剂量(100 mg/d)时血药浓度的80~120倍时,大鼠的生育能力未受影响。
对妊娠大鼠和家兔的研究结果显示,分别经口给予大剂量拉米夫定,当其血药浓度约为人临床推荐剂量时血药浓度的60倍时,拉米夫定可穿过胎盘进入胎仔体内,但均未表现出明显的致畸作用。
目前尚无拉米夫定用于妊娠妇女的严格对照的临床研究资料。但根据其在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的妊娠妇女中应用的大量资料,未发现与拉米夫定肯定相关的严重不良反应,亦未发现其对生殖过程、胚胎毒性和新生儿发育的明显影响。
国内外的若干临床观察显示,HBV感染的妊娠妇女使用拉米夫定治疗,未显示出对婴儿和母亲的不良影响。考虑其原因,可能是拉米夫定为左旋核苷类似物,因此对人体核酸无作用。
[b]阿德福韦酯(♀=C)[/b]
动物实验显示,当大鼠体内的阿德福韦酯血药浓度约为人治疗剂量时血药浓度的19倍时,亦未见对生育能力的影响。给妊娠大鼠静脉注射阿德福韦酯,在能产生明显母体毒性的剂量(相当于人推荐治疗剂量血药浓度的38倍)时,其胚胎毒性和胎仔畸形(全身性水肿、眼泡凹陷、脐疝和尾巴扭结)的发生率增高。
虽然没有足够的资料证明阿德福韦酯对妊娠妇女有不良影响,对发育中的人类胚胎的潜在危险性亦不明确,但妊娠妇女尽可能地不要使用阿德福韦酯,如确须使用,应权衡利弊。只有在潜在受益肯定大于对胎儿的风险时,才考虑在妊娠期间应用阿德福韦酯。
目前还不清楚阿德福韦酯是否可以进入人的乳汁中,所以应当告诉正在服用阿德福韦酯的母亲不要进行母乳喂养。
[b]替比夫定(♀=B)
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在动物实验中,当雄性和雌性大鼠的替比夫定血药浓度约为人治疗剂量时血药浓度的14倍时,仍未观察到其损害生育能力的证据。对妊娠大鼠和家兔的研究显示,替比夫定可以通过胎盘,但未发现致畸现象,且未显示其对胚胎和胎仔发育的不良作用。
目前尚无将替比夫定用于妊娠妇女的对照研究。动物生殖毒性研究并不总能准确预示人体反应,因此只有在利益大于风险时,方可在妊娠期间使用替比夫定。
在大鼠实验中,替比夫定能够通过乳汁分泌。但是,替比夫定是否能通过人类的乳汁分泌尚不清楚。如果母亲接受了替比夫定治疗,建议其不要进行母乳喂养。
[b]恩替卡韦(♀=C)[/b]
在连续4周给大鼠用恩替卡韦的动物实验中,药物剂量最高达30 mg/kg,结果显示,没有观察到雄性和雌性大鼠的生育能力受到影响。在妊娠大鼠实验中,研究者观察到恩替卡韦对胎鼠的毒性作用,即导致胎鼠体重降低,鼠尾和脊椎形态异常及骨化水平降低(脊椎、趾骨和指骨),并观察到胎鼠有多余的腰椎和肋骨形成。在家兔实验中,研究者观察到恩替卡韦对胎兔的毒性作用,即舌骨骨化水平降低,且出现第13根肋骨的发生率增高。
目前尚缺乏恩替卡韦用于妊娠妇女的临床试验,恩替卡韦对妊娠妇女影响的研究尚不充分,只有在对胎儿潜在的风险和利益作出充分权衡之后,方可考虑使用恩替卡韦。
恩替卡韦可通过大鼠乳汁分泌,但人乳中是否有分泌仍不清楚,因此不推荐服用本药的母亲对新生儿进行母乳喂养。
[align=center][img=136,200]http://www.cmt.com.cn/article/080925/d0401.jpg[/img][/align][align=center][font=仿宋_GB2312][size=3]妊娠妇女用药须谨慎,因为许多药物可直接影响胎儿正常发育乃至母体的健康[/size][/font][/align]
[b]育龄女性抗HBV药物的应用策略
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干扰素α是一种细胞因子,有抑制细胞增殖作用,且动物实验显示其有生殖毒性,因此准备妊娠或已妊娠的患者均禁止应用此药。
拉米夫定、替比夫定的妊娠期安全级别为B级,表明这些药物在动物实验中无致畸证据,但用于人类的安全性尚未进行充分评估,仍须继续收集相关临床资料,包括数量极少的在抗病毒治疗期间发生妊娠的病例,以便为患者提供更加可靠的治疗指导与建议。当确信女性患者在妊娠期间用药的潜在的获益超过了对患者本身及胎儿的潜在风险时,则可使用这两种药物进行治疗。
恩替卡韦和阿德福韦酯被归为妊娠期C级用药,因为在动物实验中观察到这两种药物对胚胎和胎儿有毒性作用,但这些研究并不总能预测人类的反应,还有待进一步临床研究。
[b]妊娠前的抗HBV治疗[/b]
首先,对于符合抗HBV治疗标准但近期不计划妊娠的育龄妇女,建议其选择干扰素治疗,疗程结束后6个月,可以妊娠。若在接受干扰素抗病毒期间意外妊娠,须中止妊娠。若存在一些原因患者必须继续妊娠,应立即停药,且密切监测胎儿发育情况。
其次,育龄妇女还可以考虑接受拉米夫定治疗,因为已有较多HIV感染的妊娠妇女使用拉米夫定的安全性报告。在权衡利弊后,也可考虑使用替比夫定。在治疗3~6个月,达到抗病毒疗效后,可以考虑妊娠。
[b]妊娠中的抗HBV治疗[/b]
当妊娠妇女符合抗HBV治疗标准且须接受抗HBV治疗时,应在患者及家属充分知情同意的情况下,建议使用拉米夫定或替比夫定。在患者用药期间,一定要严密监测,不仅监测胎儿情况,而且应警惕少数患者可能会在治疗早期出现丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高,而威胁母婴生命。
对于妊娠妇女,不建议用恩替卡韦和阿德福韦酯。在服用这两种药物治疗期间,如果患者准备妊娠,则建议停药。因这两种药物的半衰期在人体内均不超过24小时,亦无体内蓄积现象,理论上停药后即可考虑妊娠。如果患者在接受这两种药物治疗期间发生意外妊娠,应立即停药,中止妊娠。必须继续妊娠者,应密切监测胎儿发育情况,也可改为拉米夫定或替比夫定等B级药物继续治疗。
[b]哺乳期的抗HBV治疗[/b]
哺乳期妇女尽量不要接受抗HBV药物治疗。如确须使用,建议使用拉米夫定或替比夫定。如确须使用其他抗病毒药物,则建议停止母乳喂养。
大鼠肝窦内皮细胞的分离、培养及鉴定
肝脏是由实质细胞和非实质细胞组成的具有复杂功能的器官，其中肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells，SEC）占肝非实质细胞的40%[1]，在肝窦内形成一连续的带窗孔结构的衬垫细胞层，是肝内物质交换的屏障。与普通血管内皮细胞相比,SEC具有特殊的表面标志、结构和功能，在肝脏的生理、病理及器官移植过程中具有重要作用。但由于SEC的原代分离培养十分困难，因此阻碍了对其功能的深入研究。本研究旨在建立大鼠SEC的分离、培养及鉴定方法，为其生物学特性及功能的研究奠定基础。一、材料与方法
1. 动物、主要试剂及仪器：雄性SD大鼠，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司；Ⅳ型胶原、GBSS、Latex Beads购自美国Sigma公司，胶原S、DNA酶Ⅰ、内皮细胞生长因子（ECGF）、Annexin-Ⅴ-Fluos试剂盒购自瑞士罗氏公司， Percoll购自美国Pharmacia公司，CD14多抗（美国Santa cruz公司）由重庆医科大学龚建平教授惠赠，大鼠内皮细胞单克隆抗体RECA-1购自美国Sanbio公司；CS-15R高速冷冻离心机（美国Beckman公司）， DMIRB倒置荧光显微镜 （德国莱卡公司）。
2. 胶原酶灌注制备肝脏细胞悬液：大鼠60mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，肝素等渗盐水（125U/ml）抗凝，门静脉插管，用输液泵匀速灌注39℃ GBSS 100ml左右,阻断肝上下腔静脉，以5ml/min注入灌注液（0.5% Ⅳ型胶原）10ml, 完整剪下肝脏置于平皿中，用20ml、39℃新的灌注液（0.5% Ⅳ型胶原，0.001% DNA酶Ⅰ，5% FCS）反复灌注4～5次，去除包膜、血管及结缔组织，悬液用100目不锈钢筛网过滤，收集滤过液。
3. SEC的分离与培养：SEC的分离参照文献[2]的方法并加以改进。滤过的细胞悬液，先经差速离心收集非实质细胞，再经Percoll密度梯度离心（900×g，20min）,收集50%和25% Percoll界面层富含SEC的混浊带，离心洗涤（900×g,10min），沉淀悬于10ml DMEM条件培养基中（5% FBS,ECGF 10ng/ml），血细胞计数板计数，将细胞浓度调整为（1.2～1.5）×106/ml,加入24孔板，经37℃，体积分数5% CO2孵育20min,待库普弗细胞选择性贴壁后，收集未贴壁细胞悬液，再做细胞计数，0.4%台盼蓝染色判断细胞活力，将此悬液加入24孔板（孔底放有胶原包被的小盖玻片），每孔1ml, CO2孵箱放置5h后换液。此后2d换液1次。
4. 光镜形态学、免疫细胞化学及免疫荧光鉴定：镜下观察SEC的大小及形态学改变，培养48h后用Latex Beads胶乳颗粒吞噬实验和过氧化酶染色鉴定库普弗细胞，结蛋白染色鉴定肝星状细胞，Ⅷ因子和CD14多抗免疫细胞化学染色及RECA-1单克隆抗体免疫荧光法鉴定SEC。以PBS取代一抗作阴性对照。
5. SEC凋亡检测：在培养的不同时间用细胞刮刮下细胞，PBS离心洗涤（1000r/min，10min），按罗氏公司试剂盒说明制备样品，流式细胞仪检测细胞凋亡。
6. 统计学处理：采用SPSS10.0软件进行One-way ANOVA分析。
二、结果
1. Percoll密度梯度离心后的分层：Percoll密度梯度离心后形成4个可见带，加样层与25% Percoll之间的混浊带为细胞碎片带，25%与50% Percoll之间的混浊带为富含SEC带，库普弗细胞布满整个50% Percoll层，底部沉淀为红细胞、未定类细胞及白色结晶状物。
2. SEC细胞得率、活力及形态学变化：经多次实验（n＝5），梯度离心后SEC得率为(2.79±0.63)×107/只，经选择性贴壁后得率为(2.06±0.35)×107/只，经台盼蓝染色细胞活力为92%～95%。大部分细胞光镜下为小圆形，大小均匀，2h后开始贴壁，出现三角形或不规则形，5h后已有典型形态细胞出现，8h后细胞成团，形成单层卵石样结构，密度较稀的部位出现树枝状或网状相连，此为SEC的特征排列，随着时间延长，SEC形态逐渐变典型，呈梭形，细胞边缘清楚,细胞核突起位于中央（图1）。
3. SEC的鉴定：经鉴定培养的SEC中库普弗细胞占6%左右，肝星状细胞占4%左右。大部分细胞CD14染色阳性而Ⅷ因子染色为阴性,阳性染色位于胞浆（图2）。经RECA-1多抗间接免疫荧光法鉴定, 90%的细胞荧光染色阳性（图3）。因此培养48h的SEC纯度可达90%左右。
4. SEC的凋亡检测：新鲜分离的SEC凋亡比例较低,随着培养时间的延长，凋亡比例明显升高。培养12h的SEC凋亡比例（35.35±8.65）与新鲜分离的相比（7.36±1.40）,差异有显著性（F＝53.11, P<0.05）。
三、讨论
SEC在肝脏病理生理及器官移植中的作用已引起重视，但获得高纯度和活力的SEC是深入研究其生物学特性及功能的基础。目前国内外SEC的分离方法主要有3种,即早期的链霉蛋白酶灌注结合离心淘洗的方法[3]；经典的胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心加选择性贴壁的方法；近期日本学者所采用的胶原酶灌注结合单抗SE-1免疫磁珠法[4]。3种方法比较，离心淘洗需要特殊的仪器，成本较高，且操作复杂。免疫磁珠法所得细胞纯度最高，但得率低于Percoll法。而胶原酶灌注结合密度梯度离心的方法，既能消化完全，又能保持SEC的活性，其细胞得率和纯度较高，得率为(2.79±0.63)×107/只，培养后纯度达90%。且此法不需特殊仪器,易于推广应用。在灌注方式上，以往的研究多采用原位灌注法,该法效果较好但酶的用量大,需100ml左右；离体法节约酶的用量但消化效果欠佳。经过改进,采用原位结合离体的灌注方式既能保持血管的良好走形，使酶均匀地分布于肝脏，又能节约酶的用量,只需30ml就能得到理想的消化效果，降低了成本。影响细胞得率和活力的主要因素有：(1)酶的活性，灌注液应维持37℃，使酶的活性达最高，且最好选用同一批次的酶。(2)灌注的速度及方式，采用输液泵匀速灌注，既能冲洗干净红细胞，又能避免对肝窦内皮的损伤。原位结合离体的灌注方式既节约酶的用量又保证消化效果，灌注时还应避免气泡的产生。(3)密度梯度液的制备，Percoll液应调到适当的pH值和渗透压，不同浓度的梯度液应沿管壁缓慢加入，使之形成明显界面。(4)密度梯度离心前应严格平衡离心管,洗涤细胞时应避免用力吹打。
肝窦内皮细胞的培养条件较为苛刻，且只能短期培养。本研究经反复摸索，配制出SEC的条件培养基，用自制培养基后，SEC生长良好，形态和排列非常典型，能在体外培养5～6d。
SEC不同于普通血管内皮细胞,它具有特殊的表面标志。CD14为SEC的特异性标志物[5]，本研究所分离的细胞大部分CD14染色阳性。CD14为脂多糖的受体，正常血管内皮细胞CD14染色为阴性，SEC表面CD14的特异表达，可能与脂多糖激活SEC从而引起炎症反应及排斥反应有关，这一点值得深入研究。而SEC是否表达Ⅷ因子相关抗原,多年来一直存在争议。本研究经反复验证发现大部分SEC Ⅷ因子染色为阴性,但也有2%的细胞Ⅷ因子染色为阳性。RECA-1为大鼠内皮细胞特异性单克隆抗体，但并非SEC所特异，因此采用CD14、RECA-1、Ⅷ因子等多指标联合鉴定SEC，其结果较单指标分析更为科学。实验观察到体外培养的SEC呈生长因子抵抗的凋亡，与文献[6]报道一致。AnnexinⅤ联合碘化丙啶双染的方法可区分凋亡与坏死，其检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏，是目前最为理想的方法。该法经济、简便，且细胞得率、活力和纯度较高，形态典型，为SEC生物学特性及其功能的研究奠定了基础。
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