丙型肝炎病毒NS3区基因的克隆、表达及产物的纯化和抗原性分析
王尊文 祁自柏 于洋 谷金莲 杨振 张华远 李河民中华肝脏病杂志
[摘要]
目前，我国阻断丙型肝炎传播的主要方法是用抗丙型肝炎病毒（HCV）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂筛选供血员，国产试剂盒所用NS3抗原质量不太理想，使得国产试剂对 NS3抗体漏检较多，提高该试剂盒质量的当务之急是开发更好的HCV抗原，特别是非结构区抗原[1, 2]。为分析和比较不同长度和型别的NS3片段的抗原性，我们在大肠杆菌中表达了5个不同长度和型别的HCV NS3抗原，并作为包被抗原，按间接ELISA原理检测抗HCV国家参考品血清及部分临床样本，比较其抗原性。
1. 材料与方法：(1)血清样本：临床血清标本由本室从全国各地收集保存。抗HCV国家参考品血清，包括阳性参考品40份，阴性参考品40份。(2)质粒：含有1a型HCV cDNA的质粒pBRTM/HCV由军事医学科学院基础研究所分子疫苗室赠送，含1b型全长NS3 cDNA的质粒pGEM-T/NS3/GX由本室构建[3]。(3)分子生物学试剂和生化试剂：各种限制性内切酶及连接酶为美国Promega公司产品，Takara Ex Taq酶为大连宝生物公司产品，各种化学试剂均为分析纯试剂，离子交换层析介质和金属螯合层析介质为瑞典Pharmarcia公司产品。(4)PCR产物的获取：扩增部分长度（1192～1457aa，1180～1457aa）和型别(1a，1b)NS3基因的引物如下（正向、反向引物分别设有酶切位点EcoRI和 HindIII以及保护碱基，反向引物还设有终止密码）。pET/92/1bF 5′GCGAATTCGCGGTGGACTT CGTACCCGTT，pET/92/1bR 5′GCAAGCTTTTATCA TGTGTTACAGTCGATCACTG；pET/80/1b F 5′ GCGAATTCTTCCGGGCTGCTGTGTGC，pET/80/1bR 5′GCAAGCTTTTATCATGTGTTACAGTCGATCACTG；pET/92/1aF 5′GCGAATTCGCGGTGGACTTTATCC，pET/92/1aR 5′GCAAGCTTTTAACACGTATTGCA GTCTAT；pET/80/1aF 5′GCGAATTCTTCAGG GCCGCGGTGTGC，pET/80/1aR 5′GCAAGCTTTTA ACACGTATTGCAGTCTAT。分别取质粒pBRTM/HCV和pGEM-T/NS3/GX 为模板，加入PCR 缓冲液，dNTPs，正、反向外引物，Takara Ex Taq酶，94℃ 2min，然后 94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，扩增30个循环，最后72℃延伸5min。(5)重组表达质粒的构建、转化和鉴定：含全长1b型NS3的表达质粒pET/NS3构建，转化和鉴定见文献[3]；含不同型别，部分长度的表达质粒pET/80/1a、pET/80/1b、 pET/92/1a、pET/92/1b构建，转化和鉴定（除了将内切酶BglⅡ换为EcoRI外）同pET/NS3，鉴定正确的质粒进行核苷酸测序。(6)重组蛋白的表达：酶切鉴定和测序正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），37℃振荡培养至A550nm约为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃振荡培养5h。(7)诱导产物表达在细胞内的存在形式分析：将诱导表达5h的菌体离心后，用25mmol/L TE缓冲液悬浮，超声破碎后，离心分离上清液和沉淀，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析。(8)表达产物的纯化：以包涵体形式表达的pET/NS3，经包涵体的提取后，用Q-Sepharose FF阴离子交换柱层析纯化后，用G-50凝胶柱复性；以可溶性蛋白形式表达的pET/80/1a、pET/80/1b、pET/92/1a、pET/92/1b纯化前先将超声处理后的上清液对上样缓冲液透析过夜，除去粘稠的核酸和脂类物质，先过S-Sepharose FF阳离子层析柱，取穿过液过Ni柱获得最终纯化的目的蛋白。(9)ELISA检测方法：将纯化的目的蛋白包被酶联板，每孔加样品稀释液和待测血清，温育洗涤后。每孔加辣根过氧化物酶标记的单克隆鼠抗人IgG抗体，温育洗涤,加TMB显色液、终止液，测A450nm值。(10)Cut-off值的确定：用各个NS3片段制备的单片段试剂分别检测抗HCV国家参考品的40份阴性血清，各取平均A值加3倍标准差作为Cut-off值。
2. 结果：(1)重组表达质粒pET/80/1a、pET/80/1b、pET/92/1a、pET/92/1b经酶切鉴定正确。(2)目的蛋白的表达：pET/NS3的表达量占菌体总蛋白的29%。pET/80/1a、 pET/80/1b、pET/92/1a、pET/92/1b的表达量分别占菌体总蛋白的22%、21%、25%、23%。(3)诱导产物表达在细胞内的存在形式：重组蛋白pET/NS3主要存在于沉淀中；重组蛋白pET/80/1a、pET/80/1b、pET/92/1a、pET/92/1b存在于上清液中。(4)表达产物的纯化：pET/NS3、pET/80/1a、pET/80/1b、pET/92/1a、pET/92/1b等5个目的蛋白经柱层析及复性后，用SDS-PAGE凝胶扫描分析其纯度分别为97.5%、97.2%、96.8%、92.6%和92.2%。(5)临界值的确定：pET/NS3、pET/80/1a、pET/80/1b、pET/92/1a、pET/92/1b等5个目的蛋白检测抗HCV国家参考品40份阴性血清后计算的临界值分别为0.217、0.205、0.268、0.286、0.269。(6)对国家参考品的测试结果：用pET/NS3、pET/80/1a、pET/80/1b、pET/92/1a和pET/92/1b分别作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的抗人IgG作为第二抗体，按间接酶联免疫原理，组装单片段试剂盒分别检测第三代抗HCV国家参考品的40份阳性血清和40份阴性血清。40份阴性血清中，除pET/NS3所组装试剂检出了1例假阳性以外，其余试剂均未出现假阳性反应，符合率分别为97.5%、100%、100%、100%、100%。40份阳性血清经RIBA分析，30份血清含有抗HCV NS3抗体，5种试剂检出率分别为50.0%、80.0%、96.7%、70.0%、86.7%。从检测结果看，全长NS3片段（pET/NS3）的检出率低于部分片段的检出率；片段长度相同的情况下，1b型片段（pET/80/1b和 pET/92/1b）的检出高于1a型（pET/80/1a、pET/92/1a）；型别相同的情况下，1180～1457aa位置的片段（pET/80）的检出高于1192～S1457aa位置的片段（pET/92）。在5个片段中，pET/80/1b能检出抗HCV阳性参考品中30份抗NS3阳性的血清中的29份，显示了较好的抗原性。(7)用pET/80/1b和ORTHO HCV ELISA 3.0测试临床样本血清：为进一步比较pET/80/1b的抗原性，用pET/80/1b制备的单片段抗HCV诊断试剂和目前国际上主流的第三代抗HCV EIA诊断试剂（Ortho HCV ELISA 3.0）同时检测了92份特殊的临床样本血清。该92份血清为本室从全国各地收集，准备用于研制抗HCV国家参考品的样本,这些样本包括以下几部分，一是被一种市售的抗HCV试剂检测为阳性，二是有一种市售的试剂出现了非特异反应，三是A值在市售试剂的灰区范围内。鉴于以上特点，这些样本可以更好的来考核本研究研制的pET/80/1b的抗原性。对于本研究研制试剂与Ortho试剂检测结果不一致的样本则用有国家正式批准生产文号的抗HCV分片段试剂分析其抗体谱。
结果显示，两种试剂共同阳性标本43份，共同阴性标本40份，有9份结果不一致（表1）。
表1 pET/80/1b和Ortho试剂检测结果比较（例）
项目 pET/80/1b 合计
阳性 阴性
Ortho 阳性 43 6 49
阴性 3 40 43
合计 46 46 92
根据Chiron公司RIBA分片段试剂对pET/80/1b和ORTHO HCV ELISA 3.0检测结果不一致的9份样本的抗体谱的分析显示，在9份样品中，Ortho抗HCV EIA试剂检测为阳性而pET/80/1b单片段试剂检测为阴性的样品有6份，经分片段试剂检测抗体谱，其中不含有抗NS3抗体的有5份，说明pET/80/1b未能检出该5个样品并非为pET/80/1b抗原性差所致，Ortho抗HCV EIA试剂之所以能检测为阳性是因为该试剂中不但包含HCV NS3抗原而且还含有HCV核心（C），NS4、NS5抗原。1份样品含有很强的抗HCV核心抗体，较强的抗HCV NS4抗体，相对较弱的抗HCV NS3抗体，而用pET/80/1b检测该样品时其A值略低于Cut-off值（0.189和0.268），若能再提高pET/80/1b抗原的纯度，进一步优化试剂的组装条件，或许能检测出该阳性样品。
另外，Ortho抗HCV EIA试剂检测为阴性而pET/80/1b试剂检测为阳性的样品有3份，经抗体谱分析1份样品含有中等强度的单独抗NS3抗体，这说明pET/80/1b 将其检测为阳性是正确的。2份样品经抗体谱分析不含有任何抗HCV抗体，这说明pET/80/1b所组装试剂出现了非特异反应，这究竟是因为pET/80/1b的表达位置、抗原纯度还是试剂组装条件不合适，还有待于进一步研究。
3. 讨论：目前我国自行研制的抗HCV EIA试剂盒质量也有了很大的提高，对抗-HBc的检出率略高于进口试剂，但是对抗NS3抗体的检出率显著低于国外试剂盒。可能有几个方面的影响因素：HCV NS3抗原的表达位置，HCV的型别，纯度和构象等，本实验就这几方面进行了初步的探讨。
本实验在检测抗HCV国家标准品时发现，全长的NS3蛋白pET/NS3抗原性弱于其它4个部分NS3片段。从4个可溶性蛋白对抗HCV国家参考品的检出结果看，在片段长度相同的情况下，1b型蛋白检出率高于1a型，原因可能与中国人中1b 型HCV占多数有关[4, 5]。在型别相同的情况下，1180～1457aa位置的蛋白检出率高于1192～1457aa位置的蛋白，根据生物学软件分析，1180～1191aa并没有抗原位点，实验中延伸12个氨基酸目的是希望消除表达载体中HCV基因前面融合的组氨酸等对NS3 N端抗原位点的掩盖，通过该12个氨基酸作为柔性臂以保证NS3蛋白的正确折叠，从结果看设想是成功的。如果配上其它抗原组装检测试剂，应该有很好的检出效果。根据对抗HCV国家参考品及临床样本的检测结果，pET/80/1b似为一较好的HCV NS3抗原，如果与HCV其它抗原联合应用，应该能组装出较好的抗HCV诊断试剂，或者用于单片段试剂制备。
志谢 美国德克萨思大学杨军
参 考 文 献
[1]周诚, 祁自柏, 谷金莲, 等. 丙型肝炎病毒抗体酶标试剂盒的评价. 中华实验和临床病毒学杂志, 1998, 11: 162-165.
[2]于洋, 祁自柏, 周诚, 等. 国产抗HCV酶联免疫诊断试剂质量分析. 中国预防医学杂志, 2001, 2: 168-170.
[3]王尊文, 祁自柏, 谷金莲, 等. 中国人丙型肝炎病毒全长NS3基因的克隆、序列分析及表达. 中国生物制品学杂志, 2003, 16: 65-67.
[4]杨东亮, 郝连杰. 我国丙型肝炎病毒基因变异及分型研究现状. 中华传染病杂志, 1996, 14: 41.
[5]姚登福, 孟宪镛. 各类丙型肝炎病人基因分型的研究. 中华实验和临床病毒学杂志, 1997, 1: 80.
作者单位：100050 北京，中国药品生物制品检定所疫苗二室
通讯作者：祁自柏
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