肝癌的基因治疗
王学浩 李国强 g0bm OJ)s中华肝脏病杂志 UX;zt v f {
[摘要]
D,FK9Q | dF
原发性肝细胞癌（HCC）综合治疗方案仍然需要补充新疗法，其中基因治疗被认为是最有前途和挑战性的研究方向之一。现主要就肝癌治疗相关目的基因选择作一阐述。
1. 肝癌遗传基因治疗：(1)抑癌基因治疗：野生型p53基因是最常见的一种抑癌基因，人类肝癌组织中也可检测到p53基因突变。p53的缺失或失活在HCC中的作用仍有争议，因为80% HCC没有p53的突变；一些HCC出现p53变化，如黄曲毒素B诱发的HCC中，在编码p53序列的249密码出现一个点突变；另外，一些病毒蛋白质（如HBxAg）过度表达可使p53失活。在HCC中转导野生型p53基因的最终疗效还没有广泛地证实。利用重组腺病毒载体，将野生型p53导入p53基因突变的肝癌细胞株HepG2中，发现p53蛋白有效表达后，可诱导肝癌细胞发生凋亡，抑制肿瘤生长。HCC细胞中p53过度表达能够诱导细胞凋亡和减少肿瘤细胞的生长。相反，报道对此持消极态度，在转基因小鼠自然发生多灶性HCC模型中，将野生型p53基因导入肝组织，p53过度表达在这一模型不发挥治疗效果。在化学性诱导大鼠HCC模型中，反复动脉内注射Adp53产生疗效同样有限。究其原因，重组子在体内的转导效率或不同种系HCC细胞对p53诱导细胞死亡的敏感性可能是重要因素。除p53基因外，DCC、NF1、NF2、RB、P16、WT1、FAP、VHL等对肝癌抑制作用研究亦取得了一定成果。此外，还发现人染色体Hp11、2-p12区具有抑癌作用，将其导入不同鼠肝癌细胞系后，可明显抑制肿瘤细胞成瘤性。(2)反义疗法：目前肝癌基因治疗中采用的反义技术主要是反义寡核苷酸技术和RNA干扰技术。应用血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸在裸鼠上进行实验，发现VEGF反义核酸技术能有效下调肿瘤细胞VEGF表达，抑制肿瘤血管形成；直接以肿瘤组织内皮细胞为靶细胞的抗血管形成VEGF基因治疗，可避免长期使用肿瘤血管形成抑制因子或促血管形成因子抗体可能诱导肿瘤出现的“耐药现象”。反义核酸并不能与所有靶基因mRNA结合，即其抑制作用并不完全，由此研究者们发展了利用反义RNA的RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术。(3)表达调控治疗：肿瘤发病机制之一是存在细胞周期调控基因异常，通过人工药物，可对细胞内功能核酸3′或5′调控区进行表达调控治疗，其指导思想是把癌块周围细胞和部分癌细胞恶性度减弱，甚至变回到正常状态，从而达到抑制肿瘤生长、转移和复发的目的。5l!N5s6T.x2`%W i"A:n
2. 肿瘤药物基因治疗：(1)自杀基因治疗：主要包括单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统、水痘-带状疱疹病毒激酶/6-甲基嘌呤阿拉伯核苷(VZV-TK/AraM)系统、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因系统等。自杀基因治疗的重要特征是“旁观者效应”。旁观者效应是指被转导自杀基因的细胞将细胞毒介导给邻近非转导的细胞，并使之死亡的现象，细胞表达的HSV-TK能够诱导不表达转基因的邻近细胞死亡， 这使只需转导10%肿瘤细胞就能消灭整个肿瘤。由于转导100%肿瘤细胞很困难，旁观者效应被认为是这种疗法的主要作用机制。旁观者效应对正常细胞同样具有一定作用，如果相当数量正常细胞被偶然转导，可明显加重HSV-TK/GCV系统的肝脏毒性。(2)肿瘤药物增敏基因：这类基因产物能使细胞对已有肿瘤化疗药物的敏感性增加。如钙调素基因能增加肿瘤细胞对长春花碱类化疗药物的敏感性，降低耐药性，从而增加化疗效果。(3)肿瘤药物耐受基因：将肿瘤药物耐受基因导入正常造血干细胞或祖细胞可增加其对化疗药物的耐受剂量，间接地提高化疗的效果。如通过导入多药耐药基因，可使正常细胞获得广泛的药物耐受。
3. 肿瘤免疫基因治疗：(1)细胞因子基因治疗：研究较多的细胞因子包括：①白细胞介素-2（IL-2）：用逆转录病毒将IL-2基因转入肝癌细胞系后，表达IL-2的肝癌细胞对外周血单核细胞的敏感性最大可增强254%，且可诱导BALB/C小鼠抗癌免疫效应，导致体内肝癌自发消退。IL-2可明显增加肝癌细胞内的免疫应答水平和排斥效应。②IL-12：研究表明，将携带鼠IL-12逆转录病毒包装株在肝癌局部注射后，经IL-12基因作用后在肿瘤细胞周围有大量自然杀伤细胞（NK细胞）和CD3+细胞表达。NK细胞和CD3+细胞数可分别增加26倍和14倍，即IL-12基因作用后可明显增强肿瘤细胞的免疫原性。③肿瘤坏死因子α（TNF-α）：TNF-α基因可激活NF-κB，诱导细胞凋亡。④NKG5-SV：将NKG5-SV基因导入肝癌患者ＮＫ细胞，发现转基因后的ＮＫ细胞活性增强，对肝癌细胞株SMMC7721和HepG2的细胞毒性作用增强。在多基因联合应用的方案中，转导免疫调节细胞因子，如IL-12、GM-CSF，或通过化学引诱蛋白-1招募辅助细胞，已用于HSV-TK/GCV抗肿瘤联合治疗。(2)组织相容性复合物（MHC）5E-l9l"i Z
基因治疗：MHC在抗肿瘤免疫中具有重要地位，由于肝癌细胞表面表达的抗原分子包括肿瘤特异性抗原（TSA）及MHC-I类抗原少，甚至缺乏，可将MHC基因转移到肝癌细胞，以提高肝癌细胞MHC抗原表达，促进机体对抗原的识别和应答。有人将小鼠MHC-I基因导入人肝癌细胞，在T细胞杀伤试验中显示，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对转MHC基因肝癌细胞的杀伤明显增强；荷瘤裸鼠体内试验证实，转基因可使瘤体缩小，裸鼠生存期显著延长。(3)共刺激分子基因治疗：最近，共刺激信号的联合作用受到重视，认为是研制新型、高效肿瘤疫苗的良好靶点，这一领域中最重要的是CD28信号和4-1BB信号的协同表达。对于低免疫原性的AG104A肉瘤，单独4-1BBL或B7.1表达不能改善其免疫原性，而B7.1和4-1BBL的双表达则显著改善了野生型瘤株的免疫原性，首次接种成瘤率仅为40%，复种成瘤率仅为22%。对于高免疫原性肿瘤肥大细胞瘤P815，单独表达4-1BBL的变异株成瘤率仅为8%，同时4-1BBL的表达使机体具有针对亲本肿瘤细胞的免疫保护作用，其野生型细胞复种成瘤率为0。这说明，对低免疫原性的高度恶性肿瘤（如A20）、B7.1或B7.2单独表达均不能诱导较为完全的抗肿瘤免疫应答；附加以4-1BBL基因的协同表达，不仅使变异株具有较高的免疫原性，且可诱导机体产生针对亲本野生型肿瘤的长期免疫。6j wkwYy^Xji
4. 基因联合治疗：研究表明，多基因的联合应用优于单基因的抗瘤效果。这方面包括抑癌基因和自杀基因联合应用，或自杀基因和免疫基因联合应用。选择两种密切相关的基因作为靶基因，联合两种有协同作用的HSV TK和IL-2对鼠肝癌细胞系HepI-6的作用，比单用HSV TK有更强的杀伤和抑制肝癌细胞生长作用。p53基因结合其他促进凋亡蛋白质（如Rb蛋白）的协同表达将更加积极参与致瘤机制，因而导入单独促进凋亡基因（如p16、p27、E2F-1或E1A）或将凋亡基因与p53一起转导，利用不同促进凋亡基因和p53过度表达所产生的协同作用，可针对不同生物学特性HCC细胞产生较好的疗效。
5. 抑制血管生成和生物激活途径对肿瘤的干预：研究证实，抑制/控制与肿瘤生长有关的肿瘤新生血管生成能够大大减缓肿瘤发展。可采用血管生成抑制剂（如血管他丁或内皮他丁）来改变肿瘤血管生成。过度表达p53可通过抑制肿瘤血管生成，进而抑制体内肿瘤生长。联合使用血管生成抑制剂、激活的NK细胞、IL-12的转导可引起肿瘤缩小，达到通过不同机制（多基因、多途径）控制血管生长的目的。尽管很多研究提示，通过抑制HCC血管生成干预肝癌生成、转移和复发很有前景， 但目前有关在HCC中使用转基因方法控制血管生成鲜有报道。+TL f ]xo
对肝癌基因治疗研究取得了很多有意义的结果，但仍存在着许多问题尚待解决：(1)缺乏高效载体系统。(2)缺乏特异性导向性载体。(3)肝癌动物模型与人体肿瘤存在差异，很多基因治疗方案在实验研究中证实有效，而在临床应用中不一定有效。
通过对其他肿瘤治疗方法及肝癌发生、发展分子遗传模式的研究，对肝癌基因治疗提出以下设想：(1)在免疫基因治疗方面:可制备基因疫苗，诱导机体抗肿瘤免疫应答细胞如CTL、肿瘤浸润淋巴细胞产生强烈杀瘤作用。(2)在遗传基因治疗方面:由于肝癌发生、发展是多种癌基因激活和抑癌基因失活的结果，可望联合多个关键癌基因反义寡核苷酸或抑癌基因导入肿瘤细胞，使癌细胞回复至正常状态。此外，寻找一些针对表达调控的信息分子也是非常有希望的靶点。(3)在药物基因治疗方面：不断寻找新的药物前体激活剂基因，用于肝癌的基因治疗。
随着分子生物学、免疫学和肿瘤学研究的不断深入，外源基因转导、表达技术的提高、细胞靶向性与位点靶向性载体的构建，恶性肿瘤的基因治疗将成为一种具有广泛临床应用前景的治疗方法。ar!F'zw N oY
L3d z!w9OM4O
作者单位：210029 南京医科大学第一附属医院肝脏外科
页:
[1]