川芎嗪和大黄酸联用对大鼠肝纤维化的抑制作用
谭力学 李孝生 刘增权 刘梁英中华肝脏病杂志 Yc'hH_S
[摘要]
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研究拟用大黄酸和川芎嗪两种单体联用(简称芎黄联用)，观察二者联用的抗纤维化效应，并探讨其作用机制。 p } } O)B;M6r
一、 材料与方法_7Nt g0FXV
1. 实验动物分组及模型制备：Wistar雄性大鼠40只，每组10只。A组（模型对照组）、B组（大黄酸组）、C组（川芎嗪组）、D组（芎黄联用组）。每组动物腹部皮下注射50% CCl4色拉油，首次每100g体重0.5ml，以后每100g体重0.3ml，每3d 1次，共6周，并以5%的乙醇为惟一饮用水。在造模同时予药物干预，药物剂量的确定参考我们以前实验及文献[1，2]，B组大黄酸100mg/kg灌胃；C组川芎嗪80mg/kg灌胃; D组川芎嗪20mg/kg、大黄酸25mg/kg灌胃; A组以等量等渗盐水灌胃。
2. 指标检测：丙氨酸氨基转移酶（ALT）采用全自动生化分析仪测定。肝组织匀浆丙二醛（MDA）、肝羟脯氨酸（Hyp）含量的测定采用分光光度比色法，严格按试剂盒说明操作。肝组织纤维化程度的观察，4%多聚甲醛固定肝组织，石蜡包埋，切片4μm厚度，VG染色，光镜下观察，用北京航天大学CM2000B真彩医用软件进行图像分析，物镜×10倍，以29339.36μm2一个标准视野，每张切片随机取5个视野，测定胶原总面积，取平均值。α-平滑肌抗体（α-SMA）、范威氏因子（vWF）的免疫组织化学检测， 严格按SP试剂盒说明操作，结果判断标准：α-SMA、vWF阳性细胞表达分级，“-”基本无表达，为20＝1；“+” 阳性细胞个别聚集于病灶区，为21＝2；“++”阳性细胞三五成群聚集于病灶区，为22＝4；“+++”阳性细胞弥漫性分布23＝8，结果以分级积分表示。
3. 统计学处理：用SPSS11.0统计软件分析，多组均数比较经方差齐性检验后用方差分析。
二、结果
1. 芎黄合剂对肝功能、超氧化物歧化酶（SOD）活性、 MDA和Hyp含量的影响：ALT四组间比较，F＝17.470，P<0.01；HYP四组间比较，F＝8.050，P<0.01；SOD四组间比较，F＝25.266，P<0.01；MDA四组间比较，F＝10.019，P<0.01。见表1。0Mj sRIH6V
表1 各组大鼠ALT、Hyp、SOD、MDA的比较（x-±s）?5m eA'n5a
组别 例数 ALT（U/L） Hyp（μg/mg prot） SOD(NU/mg prot) MDA(nmol/mg prot)D&w Z.Ul8VM
A 6 193.5±15.2 2.5±2.0 58.4± 7.6 4.6±1.49Y*u"A n+[
B 8 86.2± 8.3* 1.7±0.7* 76.4± 7.2* 3.0±0.9*4\k;a1rWj'j@
C 8 70.1±15.3* 1.8±0.7* 75.5± 7.1* 3.1±0.9*^o/}&~u&j
D 9 50.4± 5.7**Δ★ 1.2±0.4**★Δ 94.8±15.6**★Δ 2.4±0.6**★Δ6jTR'{/y k8_Mx
ALT：丙氨酸氨基转移酶；Hyp：肝羟脯氨酸；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；* 与A组比较，P＜0.05，** P＜0.01；Δ 与B组比较，P＜0.05；★ 与C组比较，P＜0.05/~ y/ZV Lj0Opy
2. 芎黄合剂对肝组织胶原纤维、α-SMA、vWF表达的影响：A组可见血管周围有大量较粗胶原纤维形成并向汇管区延伸分割肝小叶。B、C、D组可见血管周围有较细的胶原纤维向汇管区延伸。免疫组织化学显示：α-SMA主要由肝星状细胞（HSC）、平滑肌细胞表达，A组在纤维间隔中, 肝窦周围、汇管区有大量表达；D组α-SMA表达很少,只在血管及胆管壁表达，汇管区少量表达；B、C组在纤维间隔及汇管区有少量表达。A组vWF在肝窦内皮细胞、中央静脉和汇管区血管壁强阳性表达。B、C、D组只在汇管区血管壁表达。胶原面积四组间比较，F＝9.412，P<0.01；α-SMA四组间比较，F＝12.003，P<0.01；vWF四组间比较，F＝11.059，P<0.01。见表2。
表2 各组大鼠肝组织胶原面积、α-SMA、vWF的-bk nl+j/d m
比较（x-±s）
组别 例数 胶原面积（μm2） α-SMA vWFB zxP5[Jhd(d o
A 6 2849.6±1478.0 5.0±2.1 4.8±1.8"|b y*at h
B 8 1394.6±1263.0* 2.4±1.3* 2.7±1.6*
C 8 1298.5±1158.0* 2.3±1.5* 2.6±1.7*
D 9 1002.2± 706.0**Δ★ 1.6±0.9**Δ★ 1.5±0.7**Δ★
α-SMA：α-平滑肌抗体；vWF：范威氏因子；与A组比较，* P＜0.05，** P＜0.01；Δ 与B组比较，P＜0.05；★ 与C组比较，P＜0.05P1U?1aZ1Y1~
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三、讨论}q*eLj e2e4@y c
研究表明芎黄联用对肝纤维化具有明显的预防作用。VG染色可见模型组胶原面积明显增多，芎黄联用组胶原面积形成明显减少。模型对照组羟脯氨酸明显升高，芎黄联用组羟脯氨酸明显降低。均证实了芎黄合剂抗肝纤维化的作用显著。且芎黄合剂在二者联用剂量仅为单用川芎嗪或大黄酸剂量的1/4的条件下，疗效却明显优于单用川芎嗪或大黄酸，提示二者产生了协同作用,可能与二者作用机制不尽相同有关。肝纤维化与氧化应激密切相关，脂质过氧化产物除通过损害肝细胞，启动肝纤维化外，还可直接激活HSC，促使肝纤维化发生发展[3]。MDA为脂质过氧化物的终末产物，其含量反映了组织中过氧化损伤的程度。SOD是重要的过氧化物裂解酶。芎黄合剂治疗组MDA显著减少，SOD活性明显增加，ALT明显降低，说明了芎黄联用可能通过其抗脂质过氧化损伤，从而保护肝细胞，改善肝功能。HSC活化是肝纤维化形成的关键[4]。结果显示模型组α-SMA表达显著增多，说明了HSC活化与肝纤维化有明显的相关性。芎黄联用组肝纤维化减轻，α-SMA表达较少，提示了芎黄联用可能通过抑制HSC活化而产生抗纤维化作用。
肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中肝功能恶化及门静脉高压症形成的病理基础之一。vWF由内皮细胞、巨核细胞合成和分泌，并储存于血管内皮细胞的Weibel-Palade小体内、血小板α颗粒及血浆中的一种糖蛋白。郝菁华等[5]研究发现vWF是内皮细胞损伤的一个标志，检测vWF表达可以反映肝纤维化的程度。实验结果显示模型组大鼠肝窦壁vWF、显著增强,且范围较广。与模型对照组比较,芎黄联用组肝窦壁vWF阳性染色显著减弱。提示芎黄联用可显著减轻肝窦毛细血管化的发生。 k7`T9j lH'a$s
参 考 文 献+m b Q!pY\w
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[1]Guo MZ, Li XS, Xu HR, et al. Rhein inhibits liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats. Acta Pharmacol Sin, 2002, 23: 739-744.
[2]李孝生, 沈鼎明, 刘长安, 等. 联用小剂量心得安与川芎嗪对肝硬化犬血液动力学的影响. 重庆医学, 1999, 28: 334-335.8R5B bw2ux N
[3]Cremonese RV, Pereira-Filho AA, Magalhaes R, et al. Experimental cirrhosis induced by carbon tetrachloride inhalation: adaptation of the technique and evaluation of lipid peroxidation. Arq Gastroenterol, 2001, 38: 40-47.
[4]Lee KS, Lee SJ, Park HJ, et al. Oxidative stress effect on the activation of hepatic stellate cells. Yonsei Med J, 2001, 42: 1-8.
[5]郝菁华, 任万华, 石军, 等. 肝脏微循环障碍在慢性乙型肝炎中的作用及其发生机制. 微循环学杂志, 2001, 11: 16-18.
作者单位：400010 重庆，重庆医科大学附属第二医院消化内科
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