幽门螺杆菌对人肝细胞系HepG2的病理作用
研究采用体外肝细胞和幽门螺杆菌（helicobacter pylori, HP）共培养，测定HP作用后HepG2细胞周期素D1（Cyclin D1）、增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA及蛋白质的表达，以探讨HP对肝细胞的病理作用。一、材料与方法
1．菌株和生长条件：ATCC49503 CagA（+）为本室保存的HP国际标准株，CC020821为HP临床株，由本室分离并鉴定为CagA（-）[1]。上述HP菌株按我室建立的方法进行培养[2]。3d后收集细菌，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗下菌落，紫外分光光度仪测定细菌浓度（1A660=1×108 CFU/ml），用含2%胎牛血清的DMEM培养基（不加双抗）调HP终浓度为1×108CFU/ml。对照细菌空肠弯曲菌（Lior4887519）购自中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所,按上述方法制备。
2. 细胞培养：人肝细胞系HepG2购自上海细胞生物研究所。HepG2采用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、体积分数为5%的CO2温箱培养，2～4d更换培养基1次，1:3常规传代培养，取对数生长期细胞进行实验。
3. 菌株与HepG2的共同孵育：细胞以1×106/孔密度接种至6孔细胞培养板,置于37℃、体积分数为5%的CO2环境中培养24h,弃去原有细胞培养液,加入DMEM培养基稀释的HP、空肠弯曲菌菌液，使细菌与细胞数之比为100:1。空白对照孔不加细菌，只加含2%胎牛血清的DMEM。分别于1、3、6、12h收集细胞，收集前用预冷磷酸盐缓冲液洗3次。每个时间点重复4孔。
4．细胞总RNA的提取：按Trizol(美国Gibco公司)RNA提取试剂盒说明进行操作,紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260/A280比值均在1.8～2.0之间，－70℃冻存。
5. 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：(1)引物设计合成：PCR引物根据GenBank中人Cyclin D1、PCNA、β-actin cDNA序列进行设计，由上海生工生物工程公司合成（表1）。(2)逆转录合成cDNA第一链：每个反应管加2μg总RNA，Olig(dT)15 1μl,用DEPC水补至总体积12μl后，70℃ 5min,冰上骤冷后加入5倍缓冲液4μl,20U/μl RNA酶抑制剂1μl，10mmol/L dNTP 2μl,200U/μl M-MuLV 1μl，37℃保温1h后,94℃灭活5min,冰上骤冷后进行PCR或-20℃保存。(3)PCR扩增：反应总体积50μl，其中10倍缓冲液5μl,4种dNTP各200μmol/L,Tag酶1U，Cyclin D1与β-actin、PCNA与β-actin引物各0.5μmol/L,模板cDNA 5μl,余下体积用无菌双蒸水补足。在DNA扩增仪（PE480）上94℃预变性4min后按表1条件进行扩增，最后72℃延伸5min。取PCR产物5μl在15g/L琼脂糖凝胶（含0.5mg/L溴化乙锭）上电泳,紫外照相，应用美国Stralagene公司Eagle EyeⅡ图像分析处理系统对电泳带密度进行扫描，获各条带光密度，然后算出每一种基因的相对表达水平(某基因的相对表达水平＝该基因RT-PCR产物电泳条带的密度/β-actin RT-PCR产物电泳条带的密度)。
6．Western blot分析：兔抗人Cyclin D1、PCNA多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自美国Sant Cruz公司,ECL增强化学发光试剂盒购自美国Amersham公司。1×106个细胞用细胞裂解液（50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，2% SDS，10%甘油，5mmol/L DTT，10mmol/L PMSF）裂解。冰上放置30min,30s超声粉碎，沸水浴变性10min，13000×g离心去除细胞碎片，用Bradford法测定上清液中蛋白浓度。等量（100μg/孔）待测蛋白在不连续SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜，用含5%去脂奶粉的0.1%磷酸盐缓冲液-Tween20室温封闭1h，分别加入Cyclin D1、PCNA多克隆抗体（1:500）4℃过夜,洗膜后加入二抗(1:2000)37℃孵育1h，最后加入ECL发光试剂，暗室内曝光X光胶片，常规方法显影、定影。Eagle EyeⅡ图像分析处理系统扫描信号密度,以吸光度值（A）对蛋白进行半定量分析。
7．统计学处理：资料经SPSS软件包处理。实验数据用x-±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），多个样本均数间每两个均数的比较采用q检验。
二、结果
1. HP处理后HepG2 Cyclin D1 mRNA、蛋白表达：以RT-PCR可在各组细胞中检测到HepG2 Cyclin D1 mRNA表达的条带。将每一泳道中Cyclin D1及β-actin基因PCR扩增条带进行凝胶扫描后图像分析发现，加入CagA（+） HP与细胞共同孵育1h后，可见Cyclin D1 mRNA表达升高，3h达高峰，约为对照的4.0倍（0.98±0.04与0.24±0.02，q＝46.31，P<0.01）。而CagA（-） HP菌液、空肠弯曲菌与HepG2细胞共同孵育后，未见CyclinD1 mRNA表达升高（资料未显示）。采用western blot观察各组细胞Cyclin D1蛋白表达，结果与相应各组细胞Cyclin D1 mRNA表达水平相吻合，经CagA（+）HP刺激的HepG2其Cyclin D1蛋白表达水平显著高于未刺激细胞，约为对照组的2.4倍（24265±1490与10110±1307，q＝15.09，P<0.01）。
2. HP处理后HepG2 PCNA mRNA、蛋白表达：以RT-PCR和western blot可在各组细胞中检测到HepG2 PCNA mRNA及蛋白表达的条带。将每一泳道中PCNA及β-actin基因PCR扩增条带进行凝胶扫描后图像分析发现，加入CagA（+）HP与细胞共同孵育3h后，可见PCNA mRNA表达升高，6h达高峰，约为对照的2.0倍（1.04±0.06与0.54±0.02，q＝31.91，P<0.01）；PCNA蛋白约为对照组的1.7倍（33869±1087与20205±1218，q＝22.19，P<0.01）。用CagA（-）HP及空肠弯曲菌处理后未见PCNA mRNA或蛋白表达升高（资料未显示）。随着处理时间的延长，Cyclin D1、PCNA mRNA及蛋白表达量呈下降趋势（表2、表3）。
表1 各聚合酶链反应引物序列、反应条件及扩增的目的片段大小
基因 引物序列 PCR反应条件 目的片段大小
细胞周期素D1 TGGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAA 94℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 1min 573bp
GGCTTCGATCTGCTCCTGGCAGGC 35个循环
增殖细胞核抗原 GCTGACATGGGACACTTA 94℃ 1min,56℃ 1min,72℃ 1min 610bp
CTCAGGTACAAACTTGGTG 35个循环
β-actin CCAGCCATGTACGTTGCTATC 94℃ 1min,55℃/56℃ 1min,72℃ 1min 150bp
CAGGTCCAGACGCAGGATGGC 35个循环
表2 幽门螺杆菌处理后HepG2细胞周期素D1、增殖细胞核抗原mRNA表达平均吸光度值（x-± s，n＝4）
组别 细胞周期素D1 增殖细胞核抗原
1 h 3 h 6 h 12 h 1 h 3 h 6 h 12 h
CagA（+） 0.76±0.04* 0.98±0.04* 0.71±0.01* 0.65±0.02* 0.56±0.02 0.76±0.02# 1.04±0.06# 0.83±0.02#
对照 0.24±0.01 0.24±0.02 0.26±0.04 0.24±0.02 0.53±0.02 0.53±0.03 0.54±0.02 0.54±0.01
与对照组同期相比，* q值分别为33.29、46.31、28.40和26.08，P<0.01；与对照组同期相比，# q值分别为14.18、31.91和18.86，P<0.01
表3 幽门螺杆菌处理后HepG2细胞周期素D1、增殖细胞核抗原蛋白质表达平均吸光度值（×103，x-± s，n=4）
组别 细胞周期素D1 增殖细胞核抗原
1 h 3 h 6 h 12 h 1 h 3h 6h 12h
CagA（+） 16.81±0.91* 24.27±1.49* 22.21±0.92* 13.53±1.39 20.71±0.98 30.96±1.43# 33.87±0.94# 24.25±1.27#
对照 10.72±2.07 10.11±1.31 10.09±1.37 10.86±2.45 20.14±0.96 20.33±1.11 20.21±1.22 20.37±1.34
与对照组同期相比，* q值分别为6.39、15.09和13.85，P<0.01;与对照组同期相比，# q值分别为12.18、22.19和4.66，P<0.01
三、讨论
为进一步研究HP是否对肝细胞有病理作用，我们应用RT-PCR和western blot的方法研究了HP对HepG2 Cyclin D1、PCNA mRNA及蛋白质表达的影响，发现CagA（+）HP对Cyclin D1、PCNA的表达有明显的上调作用,而CagA（-）HP未显示这一作用。Cyclin D1、PCNA基因和蛋白质的这种表达增加亦未出现于空肠弯曲菌与HepG2共培养时。这种作用可能是HP对HepG2的一种特异性反应。CagA（+）HP能促进HepG2 Cyclin D1、PCNA mRNA和蛋白质的表达，由于Cyclin D1、PCNA是肿瘤发生、发展的重要生物学指标，因而HP的CagA毒力因子在肝癌的发生上可能起一定作用。
参 考 文 献
[1]陈仁, 范学工, 李宁, 等. CagA(+)幽门螺杆菌体外诱导肝细胞凋亡的观察. 中国人畜共患病杂志, 2003, 19: 69-71.
[2]Fan XG, Chua A, Li TG, et al. Survial of Helicobacter pylori in milk and tap water. J Gastroenterol Hepatol, 1998, 13: 1096-1098.
基金项目：国家自然科学基金（30271171）、湖南省自然科学基金（01jjy2114）、湖南省卫生厅科研基金（00022）、国家教育部优秀骨干教师基金（教技司2000-65）
作者单位：410008 湖南长沙，中南大学湘雅医院传染科
药物性肝病104例临床分析
采用回顾性调查方法对两医院住院患者中药物性肝病病例104进行分析，现报道如下。一、资料与方法
1. 对象：1996年1月～2004年2月在河南省人民医院及郑州大学第一附属医院住院的药物性肝病患者共104例，其中男37例，女67例。年龄14～88岁，平均年龄（46±15）岁。根据服药史、临床表现、血常规、肝功能、各种肝炎病毒血清标志物及停药后治疗效果做出综合判断。
2. 方法：采用回顾性调查方式，查阅住院病历、记录服药史、临床表现、血常规、肝功能、各种肝炎病毒血清标志物检查、治疗用药及转归。其中18例患者有肝穿刺结果。
3. 统计学处理：应用SPSS10.0软件对数据进行处理。
二、结果
1. 诱发药物性肝病的药物种类：诱发药物性肝病的药物依次有：(1)30例为免疫抑制剂所致，占28.8%；(2)抗生素类（包括抗结核药物）28例，占26.9%；(3)解热镇痛药物23例，占22.1%；(4)其它类药物：中草药13例，占12.5%；性激素类5例，占4.8%、；心血管类药物３例，占2.9%；抗精神病类药物2例，占1.9%。
2. 临床表现：104例患者中临床表现轻微者较多，其中53例（51.0%）无任何肝病临床表现；8例（7.7%）仅有恶心、纳差等消化系症状；41例（39.4%）合并黄疸；5例（4.8%）单纯表现为发热、皮疹等过敏症状；8例（7.7%）表现为发热、恶心、右上腹胀疼。91例（87.5%）病例呈急性起病，用药至发病时间1～90d，平均（23.0±20.5）d。13例(12.5%)患者长期服用中药1～3年,呈慢性肝病表现，丙氨酸氨基转移酶反复升高。16例（15.4%）符合重型肝炎诊断标准[1]，其中10例为急性重型肝炎，６例为亚急性重型肝炎。
3. 基础疾病：104例药物性肝病患者的基础疾病恶性肿瘤19例，占18.3%；肾移植术后18例，占17.3%；肝病15例，占14.4%；结核病14例，占13.5%；血液病10例，占9.6%；甲状腺功能亢进9例，占8.7%；风湿热12例，占11.5%；高血脂7例，占6.7%。
4. 临床病理类型：根据Zakim分类标准，本组病例以肝功能损害或胆汁淤积为主要表现分三型。肝细胞损害型63例，占60.6%，多由免疫抑制剂、化疗药物、抗生素（包括抗结核药）及解热镇痛药物等引起，一般在服药后1周到2月发病。12例肝穿刺见病理表现：８例为肝细胞肿胀，4例有明显脂肪变。临床表现多为发热、乏力、纳差和转氨酶升高（正常值２倍以上），停药后多恢复正常。胆汁淤积型29例，占27.9%，多由免疫抑制剂及性激素类药物引起，服药时间多在１月以上，其中６例肝穿刺均证实有肝内胆汁淤积现象。临床表现多为发热、皮肤瘙痒、黄疸、右上腹痛及血清转氨酶轻度升高，总胆红素（TBil）明显升高，平均值为（346.2±191.2）μmol/L，停药后恢复较慢。混合型12例，占11.5%，其临床特点均具上述两者特征，部分两种损害均明显，部分均不明显。
5. 治疗及预后：临床一旦确诊药物性肝病，应立即停用相关可疑药物，因原发病严重而不能完全停药，且肝功能损伤尚不十分严重者，可减量使用，同时积极予以保肝治疗，如甘利欣、美能、激素、还原型谷胱甘肽、思美泰等。重症肝炎尚需予以血浆等支持治疗，本组12例TBil很高者予以人工肝支持系统治疗，很快控制病情。急性肝炎肝功能恢复正常时间为（3.6±3.3）周，淤积型肝炎恢复正常时间为（6.8±4.2）周。4例死亡患者均为重型肝炎，病死率为3.8%。
三、讨论
药物性肝病是常见的肝病之一，常被忽略而误诊为病毒性肝炎或慢性肝炎。药物引起的肝病或肝损伤在药物不良反应中占有主要的位置。中药所引起的肝脏损伤也很常见，应予以重视。 因损害肝脏药物的种类及引起肝病机制不同[2]，故药物性肝病的临床表现各异，按其起病、临床特征和疾病程度有急性和慢性之分。临床上对急性药物性肝病了解已较多，而对慢性药物性肝病较易忽略，常被误诊为病毒性肝炎或肝硬化。有相当一部分患者毫无病态，但是大部分患者的主要临床表现为血清转氨酶升高、黄疸、发热、皮疹、肝肿大、胃肠炎等消化道症状。不典型病例极易漏诊而延误治疗。 本组病例中肝损害85.6%于1月内恢复正常，偶尔也有引起急性肝功能衰竭，严重威胁患者的生命安全。12例因急性重型肝炎应用人工肝支持系统治疗病情得以缓解。
参 考 文 献
[1]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案. 中华肝脏病杂志, 2000, 8: 324-329.
[2]李健, 程香普, 崔静, 等. 36例药物性肝病的临床分析．胃肠病学和肝病学杂志, 2000, 9: 216-217, 220.
作者单位：450003 郑州，河南省人民医院消化内科（尚佳、杨玉秀、贾百灵、周炳喜、杨慧）；郑州大学第一附属医院消化内科（徐芸）
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