D-氨基葡萄糖衍生物诱导肝癌细胞凋亡的研究
通过检测D-葡萄糖衍生物对人肝癌细胞株HepG2细胞诱导凋亡的作用，为D-氨基葡萄糖衍生物治疗肝癌提供理论依据。一、材料与方法
1. 材料：人肝癌细胞株HepG2由第四军医大学病理教研室惠赠。D-氨基葡萄糖衍生物由中科院兰州化学物理研究所最新合成并提供，经蒸馏水溶解，过滤除菌，4℃冰箱保存。四甲基偶氮唑盐（MTT）、琼脂粉、RPMI 1640为美国Sigma公司产品，胰蛋白酶、丫啶橙、小牛血清为上海生物工程有限公司产品。
2．方法：人肝癌细胞株HepG2在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃ 5% CO2的培养箱中培养，48h换液1次，取对数生长期细胞悬液进行实验。实验分成0.001、0.005、0.010、0.020、0.030mmol/L 5个药物浓度组及对照组，分别于加药后24、48、72、96h测定。检测方法采用MTT法，荧光显微镜、透射电镜、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳均按常规操作。
3. 统计学处理：用Muticycle软件进行分析。
二、结果
1. MTT法检测本药对HepG2细胞的生长抑制率: 用不同浓度的D-氨基葡萄糖衍生物处理HepG2后，其生长增殖作用明显被抑制，实验组与对照组相比较差异有显著性， 随着药浓度的增加，HepG2细胞的增殖抑制率也在增加，表明本药对HepG2抑制生长作用在一定的时间范围内，随着作用时间的延长，其抑制率也相应增大（表1）。
2. 细胞形态学观察：荧光染色后正常细胞胞核饱满，呈黄色或黄绿色均匀荧光染色，胞质为橘黄色荧光。凋亡细胞则出现细胞体积明显缩小，荧光染色增强，可见致密浓染的块状或颗粒状黄绿色荧光染色，有的可呈现新月形。透射电镜见正常细胞的胞膜完整，细胞核和细胞器等微结构清晰。而凋亡细胞染色质固缩，并凝结成块，聚集在核膜周边呈新月状或肾状，胞浆浓缩，内质网疏松并与胞膜融合形成空泡。
3. 琼脂糖凝胶电泳结果：当D-氨基葡萄糖衍生物的浓度为0.010、0.020、0.030mmol/L作用48h后，在0.010、0.030mmol/L时DNA梯形带不明显，而在0.020mmol/L时可见较清晰明显的DNA 梯形带。
4. 流式细胞仪分析: 用0.010、0.020、0.030mmol/L D-氨基葡萄糖衍生物作用HepG2 48 h后，G1期前均出现典型的亚二倍体峰（凋亡峰），且随着浓度增加而增加，凋亡细胞百分率也增加，分别为4.1%、16.9%、23.5% 。
表1 D-葡萄糖的衍生物处理HepG2细胞后的吸光度A490值（x-±s）
组别 24h 48h 72h 96h
对照组 0.771±0.044 1.546±0.153 1.632±0.108 1.462±0.144
实验组 0.001mmol/L 0.777±0.035 1.196±0.066 1.410±0.073 1.350±0.030
0.005mmol/L 0.681±0.036 0.886±0.036 1.077±0.090 1.145±0.040
0.010mmol/L 0.678±0.023 0.711±0.030 0.815±0.036 0.867±0.031
0.020mmol/L 0.541±0.050 0.361±0.042 0.366±0.094 0.376±0.108
0.030mmol/L 0.352±0.072 0.142±0.017 0.194±0.029 0.176±0.014
三、讨论
D-氨基葡萄糖是一种具有生物活性的小分子，是由甲壳素降解后形成的单糖分子，不仅参与人体肝肾解毒，发挥抗炎、刺激蛋白多糖的合成,而且可以抑制肿瘤细胞的增长。通过MTT法检测显示D-氨基葡萄糖衍生物对体外培养的人肝癌细胞系HepG2有明显增殖抑制作用，并有一定的时间、浓度正向关系；应用荧光显微镜和透射电镜观察到凋亡细胞的形态学特征改变：细胞固缩，染色质凝集，细胞核碎裂，呈颗粒状或新月状；琼脂糖凝胶电泳显示加药组细胞呈明显的梯状带；流式细胞术也证实不同浓度D-氨基葡萄糖衍生物作用48 h后，不但可见凋亡细胞形成的典型亚二倍体峰，同时其凋亡率为4.1%、16.9%、23.5%。研究表明D-葡萄糖衍生物能诱导人HepG2细胞发生凋亡。
作者单位：730000 兰州，中国科学院兰州化学物理研究所（吴静、王爱勤、薛群基）；兰州医学院第一附属医院消化科（李娟、陈轩、姬瑞）；西北民族大学医学院（寇炜）
吴静现在兰州医学院第一附属医院消化科工作
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