蛋白质组学及其在肝病中的研究进展
人类基因组草图2001年的正式发表和2003年的最终完成，标志着生命科学研究进入了后基因时代。后基因时代的生命科学重心，已从解析生命的全套遗传信息（遗传密码）转移到系统研究这些遗传密码代表的实际意义（生物学功能）上来，即蛋白质的研究，从而产生了一门新的学科—蛋白质组学（proteomics）。一、蛋白质组学的概念、相关技术及研究意义
1. 概念：1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组（proteome）这个新概念，定义为“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质”，即“PROTEOME”是由蛋白质的“PROTE”和基因组的“OME”字母拼接而成。现在比较公认的概念是：一个给定的细胞或有机体在一定时间表达的所有蛋白质。
2. 相关技术：（1）用于蛋白质分离技术方面的如双向凝胶电泳（2-DE）、双向“高效”柱层析等；（2）用于蛋白质鉴定的技术如质谱技术、凝胶图像分析、蛋白质和多肽的N端、C端测序及氨基酸组成分析等；（3）用于蛋白质相互作用及作用方式研究的双杂交系统；（4）用于分析大量数据的生物工程信息学等。
3. 研究意义：蛋白质是细胞内的功能执行者，仅对DNA或mRNA进行研究并不足以阐明疾病的发病机制，也不能发现药物作用靶和诊断标志物。其原因为：（1）基因组数据库中开放阅读框的存在不一定表明一个蛋白质的存在；（2）蛋白质存在许多翻译后的修饰（如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛酸化等等）；（3）细胞内的许多调控过程并不是通过影响基因表达实现的，而是在蛋白质水平，经过对蛋白质的修饰、水解、位置的迁移、稳定性改变或改变所结合的物质（如糖、核酸、脂类、小分子或其他配体）等实现的；（4）蛋白质与蛋白质之间的相互作用，细胞内各种结构成分如细胞的分子组成只能在蛋白质水平进行研究。因此，要精确地研究基因的功能，还是要回到执行生命功能的蛋白质本身上来。目前蛋白质组学在医学方面的研究重点在于对人类疾病的发病机制、早期诊断及治疗。蛋白质组学在人类疾病研究中的应用，主要是通过比较分析正常组织细胞与异常组织细胞、同一疾病在不同发展时期细胞内整体蛋白质的表达差异，对差异表达的蛋白进行鉴定、定量、表征，寻找与疾病相关的新的标志物，为人类疾病研究提供新的手段和依据。现就蛋白质组学在肝病研究中的应用作一综述。
二、蛋白质组学在肝病中的研究进展
1. 在肝癌研究中进展：Jungblut等在用N-甲基-N-亚硝基脲诱导的小鼠肝癌中分辨出一种肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质（3.5×104/pI7.4）。而在小鼠的晶状体中，则发现一种醛糖还原酶的同工酶，该酶与已知的小鼠醛糖还原酶有98%的同源性，而与肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质截然不同。这表明两种蛋白质是由相关的两条基因编码，在小鼠不同的器官中表达不同。肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质优先表达在肝癌及胎肝中，它们均受到纤维细胞生长因子的刺激，但随小鼠器官的生理及病理环境而表现不同的形式。经免疫组化证实，肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质在癌前病变及肝癌中表达强烈，而在肝脏周围的正常组织不表达，表明该蛋白可能与肝癌的发病有很大关系。Zeindl Eberhart等在研究癌基因依赖的肿瘤相关蛋白变体蛋白质组时发现，在致癌物诱导的肿瘤中，几种肿瘤相关变体代表即是醛糖-酮类还原酶超家族成员，其中最主要的如鼠醛糖还原酶-类似蛋白-1（rARLP-1）以及rARLP-13亚型，它们在亚硝基化合物诱导的鼠肝癌中均可检测到，而鼠醛糖还原酶蛋白-c（Rak-c，一种新的肿瘤相关变体），仅在N-甲基-N-亚硝基脲诱导的肝癌中能检测；3α-羟基类固醇脱氢酶和δ4-3-甾酮-5β-还原酶（均为肝特殊酶）则减少。因此，具有解毒作用的酶如3α-羟基类固醇脱氢酶和δ4-3-甾酮-5β-还原酶在肝癌中可能被一些常出现在胚胎期的肿瘤相关蛋白如rARLP-1或Rak-c蛋白所取代。
曾嵘等对人肝癌细胞系BEL-7404双向电泳后蛋白质进行分析，并对9种蛋白质进行了鉴定，获得的氨基酸覆盖率为21%～2.2%，其中热休克蛋白27在其他癌细胞中与癌变相关。Yu等对人类肝癌细胞株BEL-7404和正常肝细胞株L-02蛋白质组进行对比研究发现，共有99个蛋白质点表达水平明显发生改变，鉴定其中的12个蛋白质点，发现6个蛋白质在肝癌细胞中表达上调，然而管状蛋白β-1链及自然杀伤细胞增强因子B在肝癌细胞中表达下调。一种肿瘤抑制蛋白，即maspin前体在正常肝细胞中表达明显增高，更有趣的是，表皮脂肪酸结合蛋白、脂肪酸结合蛋白（脂肪细胞型）仅在正常肝细胞中检测到。Yu等对反义表皮生长因子受体序列转染的人类肝癌细胞（JX-1细胞）和未转染的人类肝癌细胞（JX-0细胞）进行了蛋白质组对比分析，结果显示同JX-0细胞比较，JX-1细胞有40个表达明显的蛋白质点，其中肿瘤抑制蛋白maspin减少到正常水平，热休克蛋白27也发生明显改变，其他也在JX-1细胞中检测到有改变，表明是由肝癌细胞生长过程中翻译后修饰蛋白的动力作用引起。 Lim等分正常对照组、肝硬化组和肝癌组进行肝癌蛋白质组研究时，发现有21种蛋白存在明显改变。结果表明：肌氨酸脱氢酶E、肝羧酸酯酶、肽酰-脯氨酰异构酶A、核纤层蛋白B均可作为肝癌新标志物，核纤层蛋白B可作为肝硬化的标志物。
Park等在研究人类肝癌患者铁缺乏的分子基础时，通过2-DE和质谱分析发现，肝癌患者的一种贮铁蛋白表达明显抑制或减少到不可检测的水平，相反，转铁蛋白受体却被检测到过度表达。有趣的是，T-FLC相对应的mRNA水平与正常组织中的水平几乎一致，这表明T-FLC基因的翻译和翻译后修饰可能是引起T-FLC表达抑制的原因，而且，利用PCR为基础的杂合子丢失分析研究发现，19个肝癌患者中只有1个显示T-FLC所处的19q13.3～q13.4染色体缺乏，表明T-FLC的表达抑制不太可能是由于结构基因的改变引起。Park等利用蛋白质组学技术寻找肝癌新标志物，与正常组织相比，癌组织中醛脱氢酶3（ALDH-3）新出现3个变体，ALDH-2的2个变体几乎不可检测，而ALDH-1的4个变体几乎没有变化。表明ALDH同工酶变体的变化与肝癌密切相关，这将对肝癌基因学的研究提供新思路。
2. 在肝纤维化研究中进展：肝星状细胞（HSC）是肝间质细胞中兼有肌细胞、成纤维细胞性质的细胞，它在经过激活、刺激性增殖、表型转换后分泌大量的细胞外基质，在肝纤维化进展中发挥关键作用。Kristensen等对大鼠HSC体内及体外激活前后的蛋白质组研究，总共43种蛋白/多肽被鉴别，他们在体内外活化过程中表达水平发生改变。其中27种在体内及体外激活过程中表现出类似变化。另外，汇编了150种HSC蛋白的目录。这些数据为从蛋白水平揭示HSC活化、肝纤维化的关键性事件提供了重要的思路。在此研究基础上，Kawada等进一步发现在体内和体外实验中均存在一种与HSC激活相关的蛋白质，即STAP，分子量为2.1×104，pI为6；由于其不存在于SWISSProt或GenBankTM数据库中，表明这是一种新蛋白。STAP只在激活的HSC中丰富表达，在内皮细胞、库普弗细胞、肝实质细胞中均不表达，在静止的HSC中很少表达，因此可作为HSC激活的特异性标志物。进一步鉴定STAP，发现它是一种血红素蛋白，对过氧化氢和亚油酸氢过氧化物呈现出过氧化物酶活性。结果表明，STAP是分解代谢过氧化氢和脂质氢过氧化物的内源性新型过氧化物酶。过氧化氢和脂质过氧化物均能引起HSC活化而促进肝纤维化进程。STAP作为肝内过氧化物的清除剂而能起到抗纤维化作用。STAP的发现是运用蛋白质组技术在肝纤维化诊断方面的革新。
3. 在其他肝病研究中进展：Steiner等研究了一种降血脂药物洛伐他丁对肝蛋白质组的影响，给大鼠用药7d后检测其肝蛋白质组，发现有36种蛋白质组发生了显著变化。另外，洛伐他丁也引起了参与细胞骨架、钙内环境、蛋白酶抑制及细胞信号转导和凋亡中一些细胞应激蛋白的变化。该研究提供了探索洛伐他丁所致肝基因网络调节的新方法，提示运用蛋白质组学通过研究现有的药物作用机制有助于发现新的靶向目标。Jefferies等检测了肝片形吸虫排泄-分泌产物的蛋白质组，鉴定了凝胶中60种蛋白其中的29种。Ballot等研究自身免疫性肝炎抗可溶性肝抗原目标物蛋白质组，染色后发现3个蛋白质点，分别为3.5×104和pI 6.0、5.0×104和pI 6.0～6.5、5.8×104和pI 6.5～7.0，经质谱分析，鉴定为N-hydroxyarylamine磺基转移酶E、烯醇化酶亚型和过氧化氢酶亚型。此表明抗可溶性肝抗原抗体的抗原包括磺基转移酶E、烯醇化酶和过氧化氢酶。
4. 化学、物理因素致肝损伤：过氧化物酶体增殖物（PPs）能引起肝脏增生、抑制凋亡、过氧化物酶体增殖和肝脏肿瘤，在机体内通过过氧化物酶体增殖物活化受体α（PPARα）调节。Macdonald等在对比研究PPs刺激的野生型大鼠和PPARα缺乏大鼠的肝细胞蛋白质组时发现，在PPs刺激的野生型大鼠组有18个不同蛋白质点表达，其中几个与脂质新陈代谢以及ATP合成酶β亚单位有关；另外抗凋亡的葡糖调控蛋白94（GRP94）被发现在PPs刺激组中过度表达，这提示在PPs刺激中存在抗凋亡机制。White等研究PPAR的蛋白质组学，分为3组：PPARα促效药（Wyeth14643）、PPARγ促效药（Troglitazone）、PPARα/γ复合促效药（SB-219994）。给药后均能检测到包括脂类代谢在内的蛋白质的上调，还有一些不具有明显生物学意义的蛋白质也有改变。Newsholme等研究了一种嘧啶衍生物所导致肝脏蛋白质组的变化，发现12种增加，5种减少，其中增加最显著者为一种类似急性期反应物，即一种类似丁卡因蛋白抑制物6。Cahill等对长期给予酒精饲养的大鼠肝线粒体核糖体中蛋白质进行了2-DE分离，并对其用吸光度仪进行了定量检测，共分离出了86种蛋白质，与细胞质核糖体中蛋白质比较，其蛋白质成分水平显著下降，同时蔗糖密度梯度离心分析也显示未受损的55S核糖体数量显著减少。该研究提示酒精引起的线粒体核糖体蛋白组成的变化可能导致单核糖体的组装受损并可能导致其功能降低。Ruepp等探索了乙酰氨基酚（APAP）致肝损害后引起的肝蛋白质组及基因变化，在注射15min后，观察到肝中央小叶细胞线粒体已轻度肿胀，考虑可能与渗漏到细胞质中有关，尽管APAP是一种已知的凋亡激动剂，但没有观察到凋亡的存在。
三、结语
2001年的Science已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，其研究越来越受关注。随着蛋白质组技术的不断更新发展，蛋白质组学的研究将更为全面深入。2002年4月，我国启动国家重点基础研究发展规划项目“人类重大疾病的蛋白质组学研究”，该项研究的主要对象之一就是严重威胁中国人健康的肝病，开展肝脏蛋白质组学研究对于肝病的预防、诊断、治疗都有重大意义。目前对肝病的蛋白质组学研究包括了发病机制、新的疾病标志物的发现、药物作用靶点等方面，其中对肝癌的研究颇为深入，但对国内广泛存在的肝纤维化的蛋白质组研究却很少。因此，积极开展这方面的研究具有切实意义。
作者单位：510515 广州,南方大学中医系
谭焱 女，24岁，在读硕士研究生。
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