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van_sysu 发表于 2008-5-26 14:55

原发性肝癌中Tec的表达及其磷酸化水平

【摘要】  目的  用高通量的组织芯片技术，分析人正常肝组织、癌旁肝组织及肝癌组织中Tec的表达及磷酸化水平，探讨其表达差异的意义。 方法  用组织芯片技术结合免疫组织化学法检测肝癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织中Tec的表达及其磷酸化水平。 结果  Tec在肝癌组织及非癌组织中阳性表达率差异无统计学意义，但在肝癌组织中的染色程度显著强于非癌组织，且与组织分级有关（P<0.05）。Tec 磷酸化水平在肝癌组织（73%）高于癌旁组织（42%）及正常肝组织（10%），P<0.05。 结论  Tec的表达异常与肝癌的发生发展密切相关，抑制Tec的表达或直接降低其磷酸化水平可能影响肝癌的进程。
l/i/F!K(R 【关键词】  癌，肝细胞； 组织学； 组织芯片)q4?[V:o"N8fN9p8vI?@
The expression of Tec and the level of its phosphorylation in primary hepatic carcinomas    CHEN Chuan*, WANG Ge, ZHANG Zhi-min, XU Wen, LI Qiong, HU Qing, WANG Dong, LI Zeng-peng, YANG Zhi-xiang, SUO Jin-you, ZHENG Ji-jun, WANG Hong-zhong. *Cancer Center, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
3Oz/f9u9z&E] Corresponding author: WANG Ge, Email: wangge70@ hotmail.comtSu3f%\2i`P
【Abstract】    Objectives    To detect the expressions of Tec tyrosine kinase in hepatocelluar carcinoma  and the levels of phosphorylation of tyrosine kinase in liver cancer tissues, paracancerous tissues and normal liver tissues and to find the significance of their differences. Methods    200 specimens of tissues, including liver cancer tissues, surrounding liver tissues not more than 1.5 cm from the cancers, and normal liver tissues were investigated for Tec protein expression and Tec phosphoralaton by tissue microarrays and immunohistochemistry (SP method). Results    The positive immunohistochemical stainings of Tec in cancerous tissues and non-cancerous tissues showed no obvious differences, nevertheless, the immunostaining levels in liver cancer tissues were much higher than in non-cancerous tissues and they correlated with the grading of tumors (P < 0.05). The phosphorylation of Tec was significantly expressed in liver cancer tissues (73%) in comparison with other tissues (42%, 10% both P < 0.05), but it did not correlate with any clinicopathological characteristics. Conclusion    Overexpression of Tec is associated with the tumorigenesis and development of liver cancer; inhibiting Tec or degrading Tec phosphorylation directly might affect the progression of liver cancer.
Uh!Hw Qe 【Key words】     Carcinoma, hepatocellular;    Histology;    Tissue microarray
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RWB'A2G6oy 肝癌的形成是多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程。组织芯片技术是一种可高效研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病相关关系的方法。本研究中，我们用高通量的组织芯片技术结合免疫组织化学法检测肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中Tec蛋白的表达情况及其磷酸化水平，分析其与临床病理资料的相关性，旨在为研究肝癌的发病机制、分子靶向治疗、评估预后等提供理论依据。"_K*ByKbR
资料与方法
L'f6z:R e_ 1. 研究对象及其临床病理资料：收集第三军医大学大坪医院及第三军医大学西南医院1999-2006年肝胆外科手术切除肝癌标本、癌旁肝组织（距离肿瘤组织 1.5cm）、正常肝组织（距离肿瘤组织5cm以上）。所有组织标本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋备用。$G)?{H LY!Y
2. 试剂：Tec多克隆抗体（M-20）、Tec磷酸化抗体均购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学试剂盒（PV-9000）购自中国北京中杉金桥生物技术有限公司。 bO8c(_(HT8V5T!c
3. 方法：（1）组织芯片制作：首先对每一个供体蜡块进行切片和HE染色，光学显微镜下标记病变组织的范围。用组织阵列仪按照阵列设计抽提病理蜡块组织芯片并有规律地排列在空白受体蜡块上，以4μm的厚度连续切片。所得组织芯片的每个点都经过病理诊断。（2）免疫组织化学染色：采用SP二步法，严格按照试剂盒说明书操作。以已知阳性肝癌切片作为阳性对照，以PBS替代第一抗体作为阴性对照。qY4e%__
4. 结果判断：光学显微镜下观察染色结果，细胞质含棕黄色颗粒者为阳性细胞。在高倍镜（×400）下随机选取5个视野，计不少于1000个细胞中的阳性细胞数。以“－”表示无阳性细胞、“＋”表示阳性细胞数少于35%、“++”表示阳性细胞所占比例为35%～75%、“+++”表示阳性细胞数大于75%。*B^:^w&g7t
5. 统计学分析：采用SPSS13.0软件包进行统计分析。不同组织间Tec表达率及磷酸化水平的差异采用行列表χ2检验，肝癌组织芯片病理类型影响因素采用Logistic回归分析。
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S 结    果 g9r|:rLC$i'j;Oi
1.一般资料：共收集肝癌标本156份、癌旁肝组织24份、正常肝组织20份。肝癌组织中男115份、女41份，年龄31～82（55.28± 11.51）岁。病理学类型：肝细胞肝癌118份，肝细胞肝癌伴透明细胞6份，肝透明细胞癌6份，胆管细胞癌8份，肝内胆管癌6份，腺癌12份。~N"D'{.~ Ot?!L(\
2. 肝癌组织芯片HE染色和免疫组织化学染色结果：制备成功的肝癌组织芯片含200个位点，排列整齐，组织结构保存良好(图1)。L3}d$h
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3. Tec在肝癌、癌旁肝、正常肝组织中的表达情况：在20份正常肝组织中，15份有Tec的阳性表达，阳性率为75%；24份癌旁组织中20份有阳性表达，阳性率为83%；156份肝癌组织中，144份可见Tec的阳性表达，阳性率为92%，差异无统计学意义（P>0.05）。但在Tec为阳性表达的 15份正常肝组织中，染色程度均为“＋”（图2A）；而肝癌组织中，染色程度为“+++”的有91份（图2C），为“++”的有26份，“＋”的有27 份，明显强于肝正常组织(P<0.05，表1)。6iU'UU"a\8K
表1  （略）dZsogV} P h8H
4. 磷酸化Tec在肝癌、癌旁肝、正常肝组织中的表达情况：在正常肝组织中，磷酸化Tec的阳性表达率为10%（2/20），染色程度为“＋”（图2B）；在癌旁组织中，有10份表达磷酸化Tec，阳性率为42%，磷酸化Tec在肝癌组织中的阳性表达率为73%(114/156)，其中染色程度为“+++”的有65份（图2D），为“++”的有33份，为“＋”的有16份。三种组织的染色程度差异有统计学意义（P<0.05，表1）。
)[,}WU [\:e2Y 5. 临床病理因素与Tec表达及其磷酸化水平的关系：Tec的表达与患者年龄、性别、HBsAg、AFP等无明显相关性，但与肝癌的组织学分级有关（P<0.05，表2)。磷酸化Tec的表达与患者年龄、性别、肿瘤直径大小、分化程度等病理因素无相关性（P>0.05，表2)。.s\V_/J.r"F/l.}
讨    论i9q A5a UJ,[Q
肝癌通常由以下路径发展而来：慢性肝细胞损伤－炎症－肝再生－肝细胞外基质重建－肝纤维化，最终形成肝硬化导致肝癌。这一途径在病理学和临床上均已得到广泛认可。然而肝癌致病的分子机制却非常复杂，不同发展阶段的基因改变不尽相同，参与的信号传导系统也是极其复杂的网络，因此，揭示肝癌的分子信号通路以及癌基因的表达模式是目前研究的关键[1]。Mano等[2]报道Tec主要在肝脏表达。进一步研究发现，在肝癌细胞株PLC/PRF/5和SK －Hep1中，Tec的表达明显高于正常肝细胞，因此推测Tec的高表达对肝癌的发生发展非常重要。目前，Tec的结构已研究得比较清楚，非常类似于另一类非受体型酪氨酸蛋白激酶Src，并且Tec激酶区的酪氨酸残基pY519、pY551正是Src的作用位点[3，4]。这提示Tec可能和Src一样，在肝癌的信号传导途经中作为重要的连接分子发挥作用[4]。但目前有关Tec在肝癌中确切作用机制的文献很少。)jZ.@C
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本研究用组织芯片技术检测了肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织标本中Tec的表达及其磷酸化水平，结果显示：Tec在正常肝组织与肝癌组织中的阳性表达率无明显差异。Kazama等[5]报道Tec在肝幼红细胞中呈强阳性表达，在肝细胞中也有染色程度较弱的表达。我们曾证实：肝细胞生成素刺激或者肝部分切除均可迅速诱导Tec的表达，Tec是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因[6，7]。本实验结果显示肝组织中Tec广泛表达，这提示在正常肝组织中，Tec可能是维持肝细胞生长、增殖、分化的关键分子。本研究结果还显示，正常肝组织中Tec的染色程度明显低于肝癌组织，Tec的阳性表达率和组织分化程度相关（P<0.05），这与Kazama等[5]报道Tec在胎肝细胞与成熟肝细胞中染色程度基本相同的结果不太一致。可能是因为在肝癌形成过程中，诱导肝细胞分化的因素复杂，与正常分化过程不同，导致Tec的表达发生改变。
qVr0qE`/| 酪氨酸蛋白的磷酸化水平和程度调控着细胞的增殖、转化和侵袭等诸多生物学行为，可能是正常细胞向肿瘤细胞转化的关键环节[8]。有学者曾证实：与不转移人肝癌细胞株Hep3B相比，低、高转移细胞株MHCC97L、MHCC97H的酪氨酸磷酸化蛋白表达明显增强，提示酪氨酸磷酸化蛋白的表达差异与肝癌的侵袭转移有关[9]。本研究中，磷酸化Tec在肝癌组织中的阳性率和染色程度均高于癌旁组织及正常肝组织（P值均<0.05），说明Tec 酪氨酸磷酸化在肝癌的发生发展过程中发挥了重要作用。Tec作为胞内信号传导的重要连接分子，与细胞质内膜紧密连接，对缺乏胞内催化区的细胞表面受体相关信号的传导至关重要[10，11]，因此，我们可推测Tec正是通过自身磷酸化水平的改变激活下游底物，启动细胞内酪氨酸激酶信号级联反应，Tec表达和磷酸化水平的异常伴随着肝癌的发生发展[12]；实时抑制Tec的表达或直接降低其磷酸化水平可能会影响肝癌的进程，Tec有可能成为肝癌分子治疗的一个靶点。进一步研究Tec的下游作用底物及其参与的酪氨酸激酶途径是今后探索的方向。
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